Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Yeganeh Habibi; Christopher  J. Thibodeaux

doi:10.3791/61053

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Article de méthode

Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

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DOI :

10.3791/61053

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4 mai 2020

Yeganeh Habibi¹ , Christopher J. Thibodeaux¹

¹Department of Chemistry, McGill University

Dans cet article

Résumé

Les synthetases de lanthipeptide catalysent les réactions en plusieurs étapes pendant la biosynthèse des produits naturels peptidiques. Ici, nous décrivons un flux de travail continu, ascendant, de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) qui peut être employé pour étudier la dynamique conformationnelle des synthetases de lanthipeptide, aussi bien que d’autres enzymes semblables impliquées dans la biosynthèse de produit naturel de peptide.

Résumé

La spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est une méthode puissante pour la caractérisation biophysique des changements conformationnels enzymatiques et des interactions enzyme-substrat. Parmi ses nombreux avantages, HDX-MS ne consomme que de petites quantités de matière, peut être effectuée dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage enzymatique/substrat, et peut fournir des informations spatialement résolues sur la dynamique conformationnelle des enzymes, même pour les grandes enzymes et les complexes multiprotéines. La méthode est initiée par la dilution de l’enzyme d’intérêt dans tampon préparé en D₂O. Cela déclenche l’échange de protium dans les amides de liaison peptidique (N-H) avec le deutérium (N-D). Aux points de temps d’échange désirés, les aliquots de réaction sont trempés, l’enzyme est protéolysée en peptides, les peptides sont séparés par chromatographie liquide ultra-performante (UPLC), et le changement de masse de chaque peptide (dû à l’échange d’hydrogène contre du deutérium) est enregistré par la SEp. La quantité d’absorption de deutérium par chaque peptide dépend fortement de l’environnement local de liaison hydrogène de ce peptide. Les peptides présents dans les régions très dynamiques de l’échange d’enzymes deutérium très rapidement, tandis que les peptides dérivés de régions bien ordonnées subissent des échanges beaucoup plus lentement. De cette façon, le taux HDX rend compte de la dynamique conformationnelle des enzymes locales. Les perturbations des niveaux d’absorption du deutérium en présence de différents ligands peuvent ensuite être utilisées pour cartographier les sites de liaison ligand, identifier les réseaux allotériques et comprendre le rôle de la dynamique conformationnelle dans la fonction enzymatique. Ici, nous montrons comment nous avons utilisé HDX-MS pour mieux comprendre la biosynthèse d’un type de peptide produits naturels appelés lanthipeptides. Les lanthipeptides sont des peptides génétiquement codés qui sont modifiés post-translationnellement par de grandes enzymes multifonctionnelles et conformationnelles dynamiques qui sont difficiles à étudier avec les approches traditionnelles de biologie structurale. HDX-MS fournit une plate-forme idéale et adaptable pour étudier les propriétés mécanistes de ces types d’enzymes.

Introduction

Les protéines sont des molécules structurellement dynamiques qui échantillonnent différentes conformations sur des échelles de temps allant des vibrations des liaisons femtosecondes aux réarrangements de domaines protéiques entiers qui peuvent se produire sur plusieurs secondes¹. Ces fluctuations conformationnelles sont souvent des aspects critiques de la fonction enzymatique/protéique. Par exemple, les changements conformationnels induits par la liaison ligand sont souvent d’une importance cruciale pour moduler la fonction enzymatique, soit en organisant les résidus actifs du site nécessaires à la catalyse, en définissant les sites de liaison ....