Den presenterte protokollen kan bestemme vektorkompetansen til Aedes aegypti myggpopulasjoner for et gitt virus, for eksempel Zika, i en inneslutningsinnstilling.
Prosedyrene som presenteres beskriver en generalisert metodikk for å infisere Aedes aegypti mygg med Zika virus under laboratorieforhold for å bestemme infeksjonshastigheten, spre infeksjon og potensiell overføring av viruset i den aktuelle myggpopulasjonen. Disse prosedyrene er mye brukt med ulike modifikasjoner i vektorkompetanse evalueringer globalt. De er viktige for å bestemme den potensielle rollen som en gitt mygg (dvs. arter, befolkning, individ) kan spille i overføringen av et gitt middel.
Vektorkompetanse er definert som evnen på nivået av arter, befolkning og til og med et individ, av en gitt leddyr som mygg, kryss eller phlebotomine sandflue, for å skaffe og overføre et middel biologisk med replikasjon eller utvikling i leddyr1,2. Med hensyn til mygg og leddyrbårne virus (dvs. arbovirus), er agenten imbibed fra en viremic vert av en kvinnelig mygg. Etter inntak må viruset produktivt infisere en av en liten populasjon av midgut epitelceller3, overvinne ulike fysiologiske hindringer som proteolytisk nedbrytning av fordøyelsesenzymer, tilstedeværelsen av mikrobiota (midgutinfeksjonsbarriere eller MIB), og den utskilte peritrofiske matrisen. Infeksjon av midgut epitelet må etterfølges av replikering av viruset og eventuell flukt fra midgut inn i myggens åpne sirkulasjonssystem, eller hemolymf, som representerer utbruddet av en spredt infeksjon som overvinne midgut escape barriere (MEB). På dette tidspunktet kan viruset etablere infeksjoner av sekundært vev (f.eks. nerver, muskler og fettlegemer) og fortsette å replikere, selv om slik sekundærreplikasjon kanskje ikke er strengt nødvendig for viruset å infisere acinarcellene i spyttkjertlene (overvinne spyttkjertelinfeksjonsbarrieren). Egress fra spyttkjertelen acinar celler inn i deres apikale hulrom og deretter bevegelse inn i spyttkanalen muliggjør inokulering av viruset i etterfølgende verter på biting, og fullfører overføringssyklusen1,2,4,5,6,7.
Gitt denne godt karakteriserte og generelt bevarte spredningsmekanismen i en myggvektor, er laboratorievektorkompetansevurderinger ofte metodisk like, selv om forskjeller i protokoller eksisterer1,2. Generelt, etter oral viruseksponering, blir mygg spredd slik at individuelle vev som midgut, ben, eggstokker eller spyttkjertler kan analysees for virusinfeksjon, spredt infeksjon, spredt infeksjon / potensiell transovarial overføring, og spredt infeksjon / potensiell overføringskompetanse, henholdsvis8. Bare tilstedeværelsen av et virus i spyttkjertlene er imidlertid ikke definitive bevis på overføringsevne, gitt bevis på en spyttkjertelflukt / utgående barriere (SGEB) i noen vektor / viruskombinasjoner1,2,4,5,7,9. Standardmetoden for å bevise overføringskompetanse forblir myggoverføring til et mottakelig dyr10,11,12. Men gitt at for mange arbovirus krever dette bruk av immunkompromitterte murinmodeller13,14,15,16, denne metoden er ofte kostnadsforbudende. Et vanlig brukt alternativ er samlingen av myggspytt, som kan analyseres ved omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) eller en smittsom analyse for å demonstrere tilstedeværelsen av henholdsvis viral genom eller smittsomme partikler. Det er verdt å merke seg at slike in vitro spytt innsamlingsmetoder kan overvurdere12 eller undervurdere17 mengden virus deponert under in vivo fôring, noe som indikerer at slike data må tolkes med forsiktighet. Likevel er in vitro-metoden svært verdifull når den analyseres fra perspektivet av bare tilstedeværelse av virus i spytt, noe som indikerer overføringspotensial.
To store tilnærminger eksisterer for å bestemme rollen som myggvektorer i arbovirale sykdomsutbrudd. Den første metoden innebærer feltovervåking, der mygg samles inn i sammenheng med aktiv overføring18,19,20,21,22,23,24. Men gitt at infeksjonsratene vanligvis er ganske lave (f.eks. den estimerte infeksjonsraten på 0,061% av mygg i områder med aktiv Zika-virus (ZIKV) sirkulasjon i USA21), kan inkriminering av potensielle vektorarter være sterkt partisk ved å fangemetodikk 25,26 og tilfeldig sjanse (f.eks. prøvetaking av et infisert individ av 1600 uinfiserte) . Med tanke på dette kan en gitt studie ikke skaffe tilstrekkelig mygg i både råtall eller artsmangfold for å nøyaktig prøve mygg involvert i overføring. Vektorkompetanseanalyser gjennomføres derimot i et laboratorium, noe som gir streng kontroll over parametere som oral dose. Selv om de ikke er fullt ut i stand til å representere den sanne kompleksiteten av mygginfeksjon og overføringsevne i et feltmiljø, forblir disse laboratorievurderingene kraftige verktøy innen arbovirologi.
Basert på ulike vektorkompetanseanalyser med ZIKV i flere myggarter, populasjoner og metoder27,28,29,30,31,32, samt en nylig gjennomgang av vektorkompetansevurderinger1, beskriver vi her flere av protokollene knyttet til en typisk vektorkompetansearbeidsflyt. I disse eksperimentene, tre Ae. aegypti befolkninger fra Amerika (byen Salvador, Brasil; Den dominikanske republikk; og den nedre Rio Grande Valley, TX, USA) ble utsatt for en enkelt stamme av ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) ved 4, 5 eller 6 logg10 fokusdannende enheter (FFU) / ml doser ved hjelp av kunstige blodmel. Deretter ble de analysert for bevis på infeksjon, formidlet infeksjon og overføringskompetanse etter ulike tider med ekstrinsisk inkubasjon (2, 4, 7, 10 og 14 dager) ved hjelp av formidling og en cellekulturbasert smittsom analyse. Selv om den nåværende arbeidsflyten / protokollene er optimalisert for ZIKV, er mange elementer direkte oversettbare til andre myggbårne arbovirus i leddyrblokkering og biosikkerhetsnivå 2 og 3 (ACL / BSL2 eller ACL / BSL3).
Metodene beskrevet her gir en generalisert arbeidsflyt for å gjennomføre vektorkompetanseanalyser. Som et generelt rammeverk er mange av disse metodene bevart gjennom hele litteraturen. Det er imidlertid betydelig rom for modifikasjoner (gjennomgått i Azar og Weaver1). Virus (f.eks. viral avstamning, lagring av utfordringsvirus, viral passasjehistorie), entomologi (f.eks. laboratoriekolonisering av myggpopulasjoner, medfødt immunitet, myggmikrobiomet/virom) og eksperimentelle variabler (f.eks….
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner staben til World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton og Divya Mirchandani, for deres utrettelige arbeid med å kuratere og gi mange av de virale stammene som brukes til våre og andre gruppers vektorkompetanseforsøk. Det presenterte arbeidet ble finansiert av McLaughlin Fellowship Fund (SRA) og NIH gir AI120942 og AI121452.
3mL Standard Reservoir | R37P30 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls | 4RJH9 | Grainger | Grinding Media |
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case | A16-P4 | FisherScientific | Fixative |
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture | A6419-1G | MilliporeSigma | Reagent |
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | Primary Antibody for focus forming assay |
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle | 5450-0011 | KPL/Seracare | Secondary Antibody for focus forming assay |
Bleach | NC0427256 | FisherScientific | Decontamination |
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 | 10-126-34 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-740 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning | 07-200-91 | FisherScientific | Cell culture consumable |
Crystal Violet | C0775-100G | MilliporeSigma | Stain |
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case | 05-402-7 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-70C | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes | 14-959-49A | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case | 13-675-20 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case | 13-675-15B | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case | 13-675-30 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case | 13-675-22 | FisherScientific | Plastic consumable |
Falcon Standard Tissue Culture Dishes | 08-772B | FisherScientific | Plastic consumable |
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL | S11150 | Atlanta Biologicals | Cell culture reagent |
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides | 12-550-A3 | FisherScientific | Immobilization of Mosquitos |
FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; feeding units |
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles | 140-040-182 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle | 15-290-026 | Fisher Scientific | Cell culture reagent |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case | 15-140-163 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles | 25-200-114 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles | 11-965-118 | FisherScientific | Cell culture reagent |
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit | 7203706 | Lampire | Bloodmeal preparation |
InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | Insectary Equipment |
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case | A412-4 | FisherScientific | Fixative |
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle | M0512-250G | MilliporeSigma | Cell culture reagent |
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent | C849T34 | Thomas Scientific | Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium |
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | Immobilization of Mosquitos |
O-rings | OR37-25 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
Plastic Plugs | PP5-250 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment |
PS6 Power Unit (110-120V) | PS6120 | Hemotek Ltd | Insectary Equipment; power source |
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points | 4525 | Bioquip | Insectary Equipment |
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case | 50-809-242 | FisherScientific | Plastic consumable |
Sucrose, BioUltra, for molecular biology | 84097-250G | MilliporeSigma | Reagent |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case | 21-402-487 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-486 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-484 | FisherScientific | Plastic consumable |
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case | 21-402-482 | FisherScientific | Plastic consumable |
TissueLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogenization |
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL | 5510-0030 | Seracare | Developing solution for focus forming assay |
Vero | CCL-81 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] | CRL-1586 | American Type Culture Collection | Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay |