Summary
Cet article décrit un protocole étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo porcin de kératite bactérienne. Pseudomonas aeruginosa est utilisé comme un organisme prototypique. Ce modèle novateur imite l’infection in vivo car la prolifération bactérienne dépend de la capacité de la bactérie à endommager le tissu cornéen.
Abstract
Lors du développement de nouveaux antimicrobiens, le succès des essais sur les animaux dépend de l’extrapolation précise de l’efficacité antimicrobienne des tests in vitro aux infections animales in vivo. Les tests in vitro existants surestiment généralement l’efficacité antimicrobienne, car la présence de tissu hôte comme barrière de diffusion n’est pas prise en compte. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, nous avons développé un modèle cornéen ex vivo porcin de kératite bactérienne utilisant Pseudomonas aeruginosa comme organisme prototypique. Cet article décrit la préparation de la cornée porcine et le protocole pour l’établissement de l’infection. Les moules en verre sur mesure permettent la configuration simple de la cornée pour des études d’infection. Le modèle imite l’infection in vivo car la prolifération bactérienne dépend de la capacité de la bactérie à endommager le tissu cornéen. L’établissement de l’infection est vérifié comme une augmentation du nombre d’unités formant des colonies évaluées au moyen de dénombrements viables des plaques. Les résultats démontrent que l’infection peut être établie d’une manière hautement reproductible dans les cornées ex vivo en utilisant la méthode décrite ici. Le modèle peut être étendu à l’avenir pour imiter la kératite causée par des micro-organismes autres que P. aeruginosa. Le but ultime du modèle est d’étudier l’effet de la chimiothérapie antimicrobienne sur la progression de l’infection bactérienne dans un scénario plus représentatif des infections in vivo. Ce faisant, le modèle décrit ici réduira l’utilisation d’animaux pour les tests, améliorera les taux de réussite dans les essais cliniques et, en fin de compte, permettra la traduction rapide de nouveaux antimicrobiens à la clinique.
Introduction
Les infections cornéeennes sont d’importantes causes de cécité et se produisent dans des proportions épidémiques dans les pays à revenu faible ou intermédiaire. L’étiologie de la maladie varie d’une région à l’autre, mais les bactéries représentent une grande majorité de ces cas. Pseudomonas aeruginosa est un agent pathogène important qui provoque une maladie rapidement progressive. Dans de nombreux cas, les patients sont laissés avec des cicatrices stromales, astigmatisme irrégulier, nécessitent une greffe ou dans le pire des cas, perdreun œil 1,2.
La kératite bactérienne causée par P. aeruginosa est une infection oculaire difficile à traiter en particulier en raison de l’émergence croissante de souches résistantes aux antimicrobiens de P. aeruginosa. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que l’essai et le développement de nouveaux traitements pour les infections cornéeennes, en général, et ceux causés par Pseudomonas sp., en particulier, sont essentiels pour lutter contre la tendance actuelle de la résistanceaux antibiotiques 3.
Pour tester l’efficacité de nouveaux traitements pour les infections cornéeennes, les méthodes microbiologiques in vitro conventionnelles sont un substitut pauvre en raison de la différence de physiologie bactérienne pendant la culture de laboratoire et pendant les infections in vivo ainsi que dues au manque de l’interfacehôte 4,5. Les modèles animaux in vivo, cependant, sont coûteux, prennent beaucoup de temps, ne peuvent fournir qu’un petit nombre de répliques et soulever des préoccupations au sujet du bien-être des animaux.
Dans cet article, nous démontrons un modèle organotypique simple et reproductible ex vivo porcine de kératite qui peut être employé pour tester divers traitements pour des infections aiguës et chroniques. Nous avons utilisé P. aeruginosa pour cette expérience, mais le modèle fonctionne également bien avec d’autres bactéries, et des organismes tels que les champignons et la levure qui causent la kératite.
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Protocol
Les lapins de laboratoire albinos ont été sacrifiés en laboratoire pour d’autres travaux expérimentaux prévus dans le cadre de protocoles approuvés par le siège social. Les yeux n’étaient pas nécessaires pour une utilisation expérimentale dans ces études de sorte qu’ils ont été utilisés pour ce protocole.
1. Stérilisation
- ÉTAPE CRITIQUE : Désinfectez tous les forceps et ciseaux en trempant pendant 1 h dans la solution 5% (v/v) de Distel dans de l’eau distillée, nettoyez à l’aide d’une brosse, rincez à l’eau du robinet et stérilisez au four à 185 °C pour un minimum de 2 h.
- Stériliser toutes les autres verreries et réadageurs en clavant automatiquement à 121 °C pendant 15 minutes ou préparer les réadageurs selon les instructions du fabricant. Effectuer les procédures suivantes dans un cabinet de sécurité en microbiologie de classe II.
2. Collecte d’échantillons
- Collection d’yeux de porcin
- De grands truies blanches de landrace, une croix avec un sanglier de Hampshire a été employée. Les animaux ont été assommés par un courant électrique et les yeux ont été enucleated 2 h plus tard dans l’abattoir.
- ÉTAPE CRITIQUE : Une fois édulés, transférez les yeux au laboratoire dans une solution saline tamponnée stérile de phosphate (PBS) pour les empêcher de sécher et de les traiter immédiatement à l’arrivée.
- Collection d’yeux de lapin
- Exciser les cornées et les envoyer au laboratoire en PBS stérile.
3. Préparation du bouton cornéosclérical
- Utilisez des forceps stériles pour tenir le tissu entourant le globe oculaire et le transférer dans une boîte de Pétri. Retirez la conjonctive et le tissu musculaire autour du globe oculaire sur une boîte de Petri à l’aide de la lame de scalpel no 15 et des forceps.
- Soulevez doucement le globe oculaire tout en tenant le nerf optique avec des forceps et transférez-le dans un bocal de 0,5 L rempli de PBS stérile.
- Une fois que tous les yeux sont dégagés des tissus environnants, déplacez-les à l’aide de forceps stériles vers un autre pot de 0,5 L rempli d’iode povidone de 3 % (v/v) en PBS et laissez-le pendant 1 min.
- Transférez les globes oculaires dans un autre bocal de 0,5 L avec du PBS stérile.
- Utilisez des forceps pour maintenir l’œil immobile sur une boîte de Pétri et faire une coupe près de la cornée avec une lame de scalpel no 10A.
- ÉTAPE CRITIQUE : Tenez le bord de la coupe et utilisez des ciseaux pour exciser la cornée en laissant environ 3 mm de sclère entourant la cornée. Assurez-vous que l’extrémité pointue des ciseaux ne perce pas l’iris ou le tissu choroïde et se trouve dans l’espace supra-choroïdien.
- Tenez le bouton cornéoscleral avec des forceps et utilisez une autre paire de forceps pointus pour séparer doucement le tissu uvéal.
- Soulevez le bouton cornéosclérical du globe restant et rincez-le brièvement dans la solution d’iode de povidone de 1,5% (v/v) dans PBS dans une plaque de puits de 12.
- Placez le bouton cornéosclérical dans une autre plaque de 12 puits remplie de PBS stérile.
- Après avoir traité tous les yeux(maximum recommandé 40 yeux dansun lot), placez chaque bouton cornéoscleral à une boîte de Petri individuelle (diamètre de 34 mm) côté épithélial vers le haut et versez dans 3 mL de culture moyenne préchauffée à 37 °C.
NOTE: La composition du milieu de culture est la suivante: Dulbecco modifié Eagle’s medium (DMEM): Ham [1:1] complété par 5 μg◊mL-1 insuline et 10 ng◊mL-1 facteur de croissance épidermique (EGF), 10% (v/ v) sérum fœtal de veau (FCS), 100 U-mL-1 pénicilline, 100 U◊mL-1 streptomycine et 2,5 μg◊mL-1 amphotericine B. Comme une étape facultative, le milieu peut être complété avec 50 g◊L-1 dextran pour empêcher le gonflement de la cornée excisée pendant les étapes d’incubation supplémentaires. - Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée.
4. Entretien des boutons cornéoscléraux
- Après 24 heures, utiliser la technique aseptique pour enlever les médias et remplacer par 3 mL de médias de culture frais préchauffés contenant des antibiotiques. Gardez les boutons cornéoscléraux dans les médias avec des antibiotiques pendant 48 h pour désinfecter les cornées. Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée.
- ÉTAPE CRITIQUE : Après 48 heures, retirez les supports et rincez les cornées avec 2 mL de PBS. Ensuite, gardez les boutons cornéoscléraux dans les médias exempts d’antibiotiques pendant au moins deux ou idéalement trois jours avant l’infection expérimentale, pour éliminer les antibiotiques résiduels du tissu.
- Incuber à 37 °C dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée. Changez de média au moins une fois de plus au cours de ces trois jours. Jetez les cornées si une turbidité se développe dans le milieu sans antibiotiques.
5. Préparation d’un inoculum
- Verser 10 mL de bouillon LB dans un flacon conique de 50 mL à l’avec un bouchon en mousse.
- Transférer une colonie de souche P. aeruginosa PAO1 ou filtrer PA14 à partir d’une plaque d’agar fraîche et incuber à 37 °C pendant 3-4 h jusqu’à ce que la bactérie soit en phase médiane.
- Transférer la culture des bactéries dans un tube de 50 mL et une centrifugeuse à 3 000 x g pendant 5 min. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans PBS.
- Répétez l’étape 5.3 deux fois de plus pour laver les cellules. Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans PBS et ajuster la densité optique à 600 nm à environ 0,6 en utilisant PBS stérile comme un blanc.
6. Infecter le bouton cornéosclérical
- Retirer les supports de la boîte de Pétri et rincer les cornées deux fois avec 1 mL de PBS stérile.
- Presser doucement les forceps tout en tenant la cornée entre les deux. Utilisez un scalpel 10A pour faire quatre coupes – deux verticales, deux horizontales – dans la section centrale du bouton cornéoscleral à travers la couche épithéliale au stroma sous-jacent.
- Placez un moule en verre stérile dans une plaque de 6 puits avec la partie large vers le haut et placez la cornée au milieu du moule en verre, côté épithélium orienté vers le bas. Faire la coupe en plein centre de la partie inférieure du moule en verre.
- ÉTAPE CRITIQUE : Versez 1 mL de 1% (w/v) agar à faible point de fusion dissous dans DMEM pour remplir complètement le moule en verre de cornée.
- Laissez l’agar se fixer, puis inverser le moule en verre de sorte que l’épithélium cornéen est orienté vers le haut.
- Pipette 15 μL de la culture bactérienne avec OD600nm = 0,6 (pour P. aeruginosa cela équivaut à environ 1 x 107 unités de formation de colonie (CFU) en 15 μL) directement dans une zone coupée, puis ajouter 85 μL de PBS au sommet pour garder l’épithélium cornéen humide. Diluer la culture bactérienne restante et la plaque sur l’agar pour compter les unités formant des colonies pour l’inoculum.
- Ajouter 1 mL de DMEM sans antibiotiques au fond de chaque puits avec le moule en verre. Incuber la plaque de 6 puits avec les boutons cornéoscléraux infectés dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à 24 h.
- Installez la cornée de contrôle non infectée à côté de chaque expérience. Pour mettre en place un contrôle non infecté, remplacez les 15 μL de culture bactérienne à l’étape 6.6 par des PBS stériles.
7. Homogénéisation de la cornée pour récolter les bactéries
- Jeter le milieu DMEM du fond de la plaque de 6 puits et ajouter 1 mL de PBS stérile pour rincer le fond du puits.
- Retirez doucement le PBS en pipetage sans toucher la partie centrale du bouton cornéosclérical. Retirez l’anneau de verre à l’aide de forceps stériles et placez-le dans le Distel à 5 %.
- Rincez doucement le dessus du bouton cornéosclérical avec 1 mL de PBS deux fois [facultatif].
- Tenez le bord du bouton cornéoscleral avec de fines pointes et détachez-le de l’agar en dessous.
- Transférer la cornée dans un tube de 50 mL rempli de glace froide de 1 à 2 mL de PBS.
- Utilisez un homogénéiseur fine pointe pour sheer le dessus de la cornée infectée. Le tissu n’a pas besoin d’être complètement liquidé. L’homogénéisant aide à détacher les bactéries de l’épithélium cornéen et de la zone coupée.
- Vortex la cornée dans PBS pendant quelques secondes pour mélanger le contenu.
- Ajouter 20 μL de l’homogénéité à 180 μL de PBS et effectuer des dilutions en série dans une plaque de 96 puits.
- Diluer périodiquement la suspension à 10-4 et 10-5 dilution et pipette 10 μL de l’homogénéité diluée avec des bactéries sur une plaque d’agar sanguin. Incuber la plaque pendant 8 heures et compter le nombre de CFU. Lors de l’essai de l’effet des antimicrobiens, le facteur de dilution approprié doit être arrivé expérimentalement.
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Representative Results
La conception des moules en verre sont une idée innovante et originale, dont l’utilisation nous a permis de mettre en place le modèle d’une manière cohérente avec un minimum / pas de problèmes avec la contamination. Les moules ont été préparés par un souffleur de verre à l’Université de Sheffield sur la base d’une conception (Figure 1A). La configuration expérimentale maintient la forme convexe de la cornée et maintient les bactéries sur le dessus de l’épithélium où l’infection a lieu (Figure 1B).
Les cornées porcines gonflent habituellement après quelques jours à moyen. C’est normal et nous avons constaté qu’il n’y avait pas de différence significative entre les cornées avec et sans ajout de dextran, qui est habituellement ajouté pour prévenir l’enflure de la cornée (Figure 1H). Les cornées sont généralement blessées pour aider les bactéries à pénétrer l’épithélium. Bien qu’il n’y ait pas eu de différence significative dans le progrès de l’infection entre les cornées blessées (coupées) et non blessées (non coupées), nous avons remarqué plus de variations entre les répliques dans les cornées non coupées (figure 1C). Laver les cornées deux fois avec PBS élimine l’excès de bactéries qui ne se sont pas attachés à l’épithélium. Il y avait une différence significative dans cfu entre les cornées porcines lavées et non lavées infectées par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures (Figure 1D). Il n’y avait aucune différence significative dans les dénombrements de cfu entre les cornées de porcine et de lapin infectées par PA14 et PAO1(figure 1E,1F). Les résultats pour les deux modèles étaient reproductibles. Après 24 heures, la cornée infectée par l’une ou l’autre souche Pseudomonas développe toujours l’opacité et la zone coupée devient plus visible et ouverte par rapport à la cornée non infectée (Figure 1G).
Figure 1: Ex vivo cornée infectée par Pseudomonas aeruginosa. (A) Image schématique d’un moule en verre utilisé pour maintenir la forme de la cornée et faciliter l’introduction de bactéries et de traitements. L’épaisseur des moules en verre est de 1,5 mm et est la même que l’épaisseur des tubes à essai en verre borosilicate. (B) Image schématique de la mise en place expérimentale. (C) Tester l’effet de la blessure sur le décompte final de l’UNIVERSITÉ après homogénéisation. Les cornées non coupées (n = 16) et coupées (n = 28) ont été infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures. Les cornées ont été lavées avec 1 mL de PBS avant homogénéisation. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (D) Tester l’effet du lavage des cornées avec 2 x 1 mL de PBS (n = 6) et ne pas laver (n = 6) sur le décompte final de la CFU après l’infection par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (E) Compte final de CFU dans les cornées porcines infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures (n = 10). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (F) Compte final de CFU dans les cornées de lapin infectées par P. aeruginosa PAO1 et P. aeruginosa PA14 pendant 24 heures (n = 6). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. (G) Photos de cornées porcines ex vivo infectées par P. aeruginosa PAO1 pendant 24 heures. Le contrôle a été blessé, mais aucune bactérie n’a été ajoutée. Les cornées infectées ont été blessées et 107 CFU ont été ajoutés au côté coupé. Aucun CFU n’a été récupéré de la cornée de contrôle. (H) Le CFU final s’est rétabli après 24 heures d’infection par P. aeruginosa PAO1 des cornées traitées par dextran (n = 2) et celles sans dextran (n = 9). Les cornées ont été lavées et coupées. Les barres d’erreur indiquent l’écart type. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Le principal moteur du développement de ce modèle de kératite à l’aide de la cornée porcine ex vivo est de fournir aux chercheurs qui mettent au point de nouveaux antimicrobiens un modèle in vitro représentatif afin de déterminer plus précisément l’efficacité des antimicrobiens aux stades précliniques. Cela permettra aux chercheurs impliqués dans le développement de nouveaux antimicrobiens de mieux contrôler la conception et la formulation des médicaments aux stades précliniques, d’accroître le succès des essais cliniques, de réduire l’utilisation des animaux en permettant des études ciblées et d’accélérer la traduction de nouveaux antimicrobiens à la clinique.
Un certain nombre d’études ont étudié l’effet des infections sur les cornées ex vivo de divers animaux tels que: lapin6,chien 7,chèvre 8 etporcs 9,10,11. La plupart de ces études se concentrent sur les moyensd’établir 6 et de visualiser une infection9, mais jusqu’àprésent,il n’y a eu que quelques publications axées sur le dépistage des drogues et la quantificationprécise des bactéries 6,7,8,12.
Le principal avantage de notre modèle est la disponibilité des cornées porcines dans le cadre de la chaîne alimentaire. L’utilisation de cornées porcines ex vivo s’aligne donc sur le principe des 3R, qui est de remplacer, affiner et réduire l’utilisation des animaux dans la recherche, tout en fournissant un modèle représentatif de l’interface hôte. Nous n’avons observé aucun problème avec la contamination des explants cornéeens si le protocole est strictement suivi. Les moules en verre sont très faciles, rapides et simples à utiliser sans aucune exigence pour l’équipement spécialisé. L’anneau étroit en haut rend pratique l’ajout d’une petite quantité d’un médicament testé (100 μL) ou d’une bactérie. L’anneau du moule en verre permet pbs avec des bactéries ou une solution médicamenteuse d’être conservé dans la partie centrale de la cornée et empêche les bactéries de passer sous la cornée. L’anneau est facile à nettoyer et à stériliser, et permet l’observation des changements qui se produisent sur le dessus de la cornée pendant l’infection. Les souches de bactéries étiquetées fluorescentes peuvent être utilisées pour visualiser l’infection ou quantifier la propagation de l’infection dans le tissu à l’aide d’une microscopie confocale fluorescente. Les cornées entières peuvent être traitées davantage pour l’histologie ou l’imagerie par microscopie électronique.
Les étapes critiques sont marquées dans le protocole. Une attention particulière doit être accordée à ces étapes lors de l’exécution du protocole pour assurer le succès de l’infection. Les étapes les plus critiques du protocole sont de s’assurer que les cornées sont traitées avec suffisamment d’antibiotiques pour prévenir l’infection pendant la préparation, puis que les antibiotiques sont suffisamment éliminés avant l’introduction de l’organisme infectieux, dans ce cas P. aeruginosa. Lors de la mise en place des expériences utilisant ce protocole, dans certains cas, la turbidité s’est développée pendant l’incubation dans le milieu sans antibiotiques. Cette turbidité était indicative de la croissance des micro-organismes dans le milieu antibiotique-libre. Cela peut être dû à un traitement incomplet de la cornée à l’aide des antibiotiques ou en raison de la contamination pendant la manipulation. Ces cornées n’ont pas été avancées pour d’autres expériences et ont été jetées. Le développement de la turbidité lors de l’incubation des cornées dans un milieu sans antibiotiques a été évité en utilisant des courses fréquentes de stérilisation dans l’incubateur, en utilisant des pointes de pipette jetables avec un filtre et en prenant suffisamment soin lors de la stérilisation des outils utilisés pour exciser la cornée des yeux porcins. Une autre étape critique est quand les cornées sont placées dans le moule en verre avant l’infection. Le moule en verre permet de maintenir la forme convexe de la cornée. La convexité de la cornée est un défi pour la rétention de la dose infectieuse ou de l’agent thérapeutique à la surface de la cornée. Par conséquent, il est essentiel d’assurer la présence d’un joint adéquat entre la cornée et le moule en verre. Quand il y a le joint proportionné entre la cornée et le moule en verre, la structure d’anneau au-dessus du moule crée un réservoir pour retenir la dose infectieuse ou l’agent thérapeutique. Un joint adéquat est assuré en remplissant complètement la large section du moule en verre avec de l’agar DMEM jusqu’au bord.
Comme c’est le cas avec n’importe quel modèle, il y a des limitations liées au modèle ex vivo de cornée porcine décrit. Le modèle décrit ci-après n’imite pas la composition, le flux et la reconstitution du film de déchirure à travers la cornée. L’action mécanique fournie par le clignotement n’est pas non plus incorporée dans le modèle. Il y a accord dans la littérature que la composition et la dynamique de film de déchirure, et le clignotement sont des mécanismes de défense importants qui enlèvent des particules et des micro-organismes étrangers del’oeil 13. En effet, le modèle manque également d’une réponse immunitaire qui est déclenchée lors de l’infection in vivo. Il est probable que la progression de l’infection in vivo en présence de ces mécanismes de défense est différente de celle observée dans le modèle ex vivo décrit ici. Malgré ces limitations, le modèle cornéen ex vivo porcin est pertinent pour tester l’efficacité des antimicrobiens existants et émergents pour deux raisons principales : 1) la physiologie des bactéries dans le modèle ex vivo imite les conditions in vivo car la prolifération bactérienne dépend de leur capacité à endommager le tissu cornéen, et 2) le modèle intègre le tissu tridimensionnel comme barrière de diffusion pour les thérapeutiques un peu comme dans la situation in vivo. Par conséquent, le modèle ex vivo est avantageux par rapport aux techniques conventionnelles pour les tests de susceptibilité aux antimicrobiens.
Le modèle de cornée porcine ex vivo décrit ici peut également être utilisé pour étudier différentes souches de bactéries, champignons et levures qui causent la kératite. Ce modèle ex vivo cornée est reproductible et permet de générer des répliques en peu de temps contrairement aux modèles in vivo. Au lieu de PBS, des larmes artificielles ou des cellules de défense immunitaire hôte peuvent théoriquement être ajoutés pour imiter le scénario en direct. Corneas sont obtenus à partir de la même race de porcs et environ 21-23 semaines lors de l’abattage. Par conséquent, il y a moins de variabilité entre les répliques que celles obtenues à partir de cadavres humains. Le concept d’utilisation d’un modèle de cornée porcine ex vivo pour des applications biomédicales a gagné plus de popularité au cours des dernières années en raison de sa similitude biologique avec l’œil humain qui rend ce modèle plus facileà comparer 14. Il y a un intérêt accru dans l’utilisation des cornées porcines pour la transplantation15,16 ou comme modèle pourl’oeil sec 17 ou la guérison deblessure 18.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Elliot Abattoir à Chesterfield d’avoir fourni des yeux de porcine. Les anneaux de verre ont été fabriqués sur la base de notre conception par le souffleur de verre Dan Jackson du département de chimie de l’Université de Sheffield. Les auteurs remercient le Conseil de recherches médicales (MR/S004688/1) pour son financement. Les auteurs remercient également Mme Shanali Dikwella pour son aide technique à la préparation de la cornée. Les auteurs remercient M. Jonathan Emery pour leur aide dans la mise en forme des images.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
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