מתואר כאן היא שיטה לניצול עוברי דגי זברה כדי ללמוד את היכולת של חלקיקים פונקציונליים למקד תאים סרטניים אנושיים vivo. שיטה זו מאפשרת הערכה ובחירה של חלקיקים אופטימליים לניסויים עתידיים בבעלי חיים גדולים ובניסויים קליניים.
פיתוח חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, ולהרוס תאים סרטניים הוא עניין רב בתחום של ננו-תרופות. במודלים של בעלי חיים vivo נדרשים לגישור הננוטכנולוגיה ליישום הביו-רפואי שלה. העכבר מייצג את המודל החיי המסורתי לניסויים פרה-לקלינליים; עם זאת, עכברים יקרים יחסית לשמור ויש להם מחזורים ניסיוניים ארוכים בשל צרגיות מוגבלות מכל אמא. דגי הזברה התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקר התפתחותי וביו-רפואי, כולל חקר הסרטן. בפרט, בשל השקיפות האופטית שלה והתפתחות מהירה, עוברי דגי זברה מתאימים היטב בזמן אמת בניטור vivo של ההתנהגות של תאים סרטניים והאינטראקציות שלהם עם המיקרו-סביבה שלהם. שיטה זו פותחה כדי להציג באופן רציף תאים סרטניים אנושיים וחלקיקים פונקציונליים בעוברי דגי זברה קספר שקופים ולפקח על זיהוי vivo ומיקוד של התאים הסרטניים על ידי חלקיקים בזמן אמת. פרוטוקול ממוטב זה מראה כי חלקיקים פלואורסצנטים מתויגים, אשר פונקציונליים עם קבוצות חומצה פולית, יכול במיוחד לזהות ולמכון גרורתי תאים סרטניים אפיתל צוואר הרחם מתויג עם פלואורוכרום שונה. תהליך הזיהוי והאיקוד יכול להתרחש כבר ב-30 דקות לאחר הבדיקה של החלקיקים שנבדקו. כל הניסוי דורש רק רבייה של כמה זוגות של דגים בוגרים ולוקח פחות מ-4 ימים להשלים. יתר על כן, עוברי דגי זברה חסרים מערכת חיסונית אדפטיבית פונקציונלית, המאפשרת את ההתעמלות של מגוון רחב של תאים סרטניים אנושיים. לפיכך, השירות של הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בדיקה של חלקיקים על סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים, הקלה על הבחירה של חלקיקים אופטימליים בכל הקשר סרטן ספציפי לבדיקות עתידיות ביונקים והמרפאה.
התפתחות חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, והשמדת תאים סרטניים הוא עניין רב הן פיזיקאים וחוקרים ביו-רפואיים. הופעתו של ננו-תרופות הובילה להתפתחות של מספר חלקיקים, כגון אלה התווססו עם ליגנדים מיקוד ו / אותרופות כימותרפיות 1,,2,,3. המאפיינים הנוספים של חלקיקים מאפשרים את האינטראקציה שלהם עם המערכת הביולוגית, חישה וניטור אירועים ביולוגיים ביעילות גבוהה ודיוק יחד עם יישומים טיפוליים. חלקיקי תחמוצת זהב וברזל משמשים בעיקר בטומוגרפיה ממוחשבת ויישומי הדמיית תהודה מגנטית, בהתאמה. בעוד הפעילויות אנזימטיות של זהב וחלקיקים תחמוצת ברזל לאפשר זיהוי של תאים סרטניים באמצעות אסיאים צבע, חלקיקי פלורסנט מתאימים היטב ביישומים הדמיה vivo4. ביניהם, חלקיקי פלורסנט ultrabright מועילים במיוחד, בשל יכולתם לזהות סוגי סרטן מוקדם עם פחות חלקיקים ורעילות מופחתת5.
למרות יתרונות אלה, חלקיקים דורשים ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים vivo לבחירה של ננו חומרים מתאימים אופטימיזציה של תהליך הסינתזה. בנוסף, בדיוק כמו סמים, חלקיקים מסתמכים על מודלים של בעלי חיים לבדיקות פרה-קרטיות כדי לקבוע את היעילות שלהם ואת הרעלים. המודל הקדם-לקליני הנפוץ ביותר הוא העכבר, שהוא יונק שתחזוקה שלו מגיעה בעלות גבוהה יחסית. עבור מחקרי סרטן, או עכברים מהונדסים גנטית או עכברים xenografted משמשים בדרךכלל 6,7. אורך הניסויים הללו משתרע לעתים קרובות בין שבועות לחודשיים. בפרט, עבור מחקרי גרורות סרטן, תאים סרטניים מוזרקים ישירות לתוך מערכת הדם של העכברים במקומות כגון ורידים זנבטחול 8,9,10. מודלים אלה מייצגים רק את השלבים הסופיים של גרורות כאשר תאים סרטניים מתפשטים ליישב איברים רחוקים. יתר על כן, בשל בעיות ניראות, זה מאתגר במיוחד כדי לפקח על נדידת תאים סרטניים, פילוח nanoparticle של תאים סרטניים בעכברים.
דגי הזברה (Danio rerio) הפכו למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה לחקר הסרטן בשל הפוריות הגבוהה שלה, עלות נמוכה, התפתחות מהירה, שקיפות אופטית ושימורגנטי 11,12. יתרון נוסף של דגי הזברה על פני מודל העכבר הוא הפריה של ביצי הדגים אקס רחם, המאפשר לעוברים להיות במעקב לאורך כל התפתחותם. ההתפתחות העוברית מהירה בדגי זברה, ובתוך 24 שעות לאחר הפוריות (HPF), מטוס הגוף החוליות כבר יצר13. ב-72 כ”ס, הביצים בקעות מהצ’וריון, ועוברות מהעובר לשלב הטיגון. השקיפות של דגי הזברה, זן קספר בפרט 14, מספקת הזדמנות ייחודית לדמיין את הנדידה של תאים סרטניים ואת ההכרה שלהם ומיקוד על ידי חלקיקים בחיה חיה. לבסוף, דגי זברה לפתח את המערכת החיסונית המולדת שלהם על ידי 48 hpf, עם המערכת החיסונית אדפטיבית מפגר מאחור ורק הופך פונקציונלי ב 28 ימים לאחרפוריות 15. פער זמן זה הוא אידיאלי עבור השתלה של סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים לתוך עוברי דגי זברה מבלי לחוות דחיות חיסוניות.
מתואר כאן היא שיטה המנצלת את השקיפות וההתפתחות המהירה של דגי זברה כדי להדגים את ההכרה ואת מיקוד של תאים סרטניים אנושיים על ידי חלקיקים פלורסנט ב vivo. באסיי זה, תאים סרטניים צוואר הרחם האנושי (תאי HeLa) מהונדסים גנטית לבטא חלבון פלורסנט אדום הוזרקו לאזור כלי הדם בחלל perivitelline של 48 עוברי HPF. לאחר 20-24 שעות, תאי HeLa כבר התפשטו ברחבי העוברים דרך מערכת הדם של הדגים. עוברים עם גרורות לכאורה היו microinjected עם ~ 0.5 nL של תמיסת ננו-חלקיקים ממש מאחורי העין, שם ממוקם מיטת הנכים העשירה. באמצעות טכניקה זו, חלקיקי סיליקה פלורסנט אולטרה-ברייט יכולים למקד תאי HeLa במהירות של 20-30 דקות לאחר ההתזמה. בשל הפשטות והיעילות שלה, דגי הזברה מייצגים מודל vivo חזק כדי לבדוק מגוון רחב של חלקיקים ליכולתם למקד תאים סרטניים ספציפיים.
הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את דגי הזברה כמערכת vivo כדי לבדוק את היכולת של חלקיקים לזהות ולכוון תאים סרטניים אנושיים גרורתיים. מספר גורמים יכולים להשפיע על ביצוע מוצלח של הניסויים. ראשית, עוברים צריכים להיות מפותחים במלואם ב 48 hpf. השלב ההתפתחותי הנכון של העוברים מאפשר להם לסבול ולשרוד את ההשת…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לגב’ קיילי סמית’ לורן קווק ולמר אלכסנדר פלורו על הגהת כתב היד. H.F. מכירה בתמיכת מענקים של ה-NIH (CA134743 ו-CA215059), האגודה האמריקנית לסרטן (RSG-17-204 01-TBG) וקרן סנט בולדריק. F.J.F.L. מכיר במחווה ממרכז החדשנות של אוניברסיטת בוסטון-BUnano הכשרה חוצת משמעת בננוטכנולוגיה לסרטן (XTNC). I.S מאשרת תמיכה ב-NSF (מענק CBET 1605405) ו-NIH R41AI142890.
Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |