في فيفو استهداف الخلايا السرطانية البشرية Xenografted مع وظيفية السيليكا النانوية في حمار وحشي
Summary
وصف هنا هو وسيلة لاستخدام أجنة حمار وحشي لدراسة قدرة الجسيمات النانوية وظيفية لاستهداف الخلايا السرطانية البشرية في الجسم الحي. هذه الطريقة تسمح لتقييم واختيار الجسيمات النانوية المثلى للاختبار في المستقبل في الحيوانات الكبيرة وفي التجارب السريرية.
Abstract
إن تطوير جسيمات نانوية قادرة على اكتشاف الخلايا السرطانية واستهدافها وتدميرها أمر له أهمية كبيرة في مجال التطبيب النانوي. في نماذج الحيوانات الحية مطلوبة لسد تكنولوجيا النانو لتطبيقها الطب الحيوي. الماوس يمثل نموذج الحيوان التقليدي للاختبار قبل الفحص؛ ومع ذلك، الفئران مكلفة نسبيا للحفاظ على ولها دورات تجريبية طويلة بسبب ذرية محدودة من كل أم. وقد برز الحمار الوحشي كنظام نموذجي قوي للبحوث التنموية والطبية الحيوية، بما في ذلك أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، نظراً لشفافية بصرية وتطور سريع، أجنة حمار وحشي مناسبة تماما في الوقت الحقيقي في رصد الجسم الحي لسلوك الخلايا السرطانية وتفاعلاتها مع البيئة الدقيقة. وقد تم تطوير هذه الطريقة لإدخال الخلايا السرطانية البشرية والجسيمات النانوية الوظيفية بشكل تسلسلي في أجنة حمار وحشي شفافة من كاسبر ورصدها في التعرف على الخلايا السرطانية واستهدافها بواسطة الجسيمات النانوية في الوقت الحقيقي. ويبين هذا البروتوكول الأمثل أن الجسيمات النانوية المسماة بالفلورسنت، والتي يتم وظيفياً مع مجموعات الفولات، يمكنها أن تتعرف على وجه التحديد على الخلايا السرطانية الظهارية البشرية النقيلية البشرية المستهدفة بفلوروكروم مختلفة. يمكن أن تحدث عملية التعرف على المواد المستهدفة في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الحقن من الجسيمات النانوية التي تم اختبارها. التجربة كلها تتطلب فقط تربية بضعة أزواج من الأسماك الكبار ويستغرق أقل من 4 أيام لإكمال. وعلاوة على ذلك، تفتقر أجنة أسماك الحمار الوحشي إلى نظام مناعي متكيف وظيفي، مما يسمح بgraftmenting من مجموعة واسعة من الخلايا السرطانية البشرية. ومن ثم، فإن فائدة البروتوكول الموصوف هنا تمكن من اختبار الجسيمات النانوية على أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية البشرية، مما يسهل اختيار الجسيمات النانوية المثلى في كل سياق سرطان محدد للاختبار في المستقبل في الثدييات والعيادة.
Introduction
إن تطوير الجسيمات النانوية القادرة على اكتشاف الخلايا السرطانية واستهدافها وتدميرها أمر له أهمية كبيرة لكل من علماء الفيزياء والباحثين في الطب الحيوي. أدى ظهور التطبيب النانوي إلى تطوير العديد من الجسيمات النانوية ، مثل تلك التي ترافقت مع يغاندس الاستهداف و / أو الأدوية العلاجية الكيميائية1،2،3. الخصائص المضافة للجسيمات النانوية تمكن من تفاعلها مع النظام البيولوجي، واستشعار ورصد الأحداث البيولوجية بكفاءة عالية ودقة جنبا إلى جنب مع التطبيقات العلاجية. وتستخدم الجسيمات النانوية أكسيد الذهب والحديد في المقام الأول في التصوير المقطعي المستخدم وتطبيقات التصوير بالرنين المغناطيسي، على التوالي. في حين أن الأنشطة الأنزيمية من الذهب والحديد جسيمات نانوية أكسيد يسمح الكشف عن الخلايا السرطانية من خلال المقايسات colorimetric، جسيمات نانوية الفلورسنت هي مناسبة تماما لفي تطبيقات التصوير vivo4. من بينها، الجسيمات النانوية الفلورية فائقة الوضوح مفيدة بشكل خاص، وذلك بسبب قدرتها على الكشف عن السرطانات في وقت مبكر مع جزيئات أقل والحد من السمية5.
على الرغم من هذه المزايا، تتطلب الجسيمات النانوية التجريب باستخدام نماذج الحيوانات الحية لاختيار المواد النانوية المناسبة والاستفادة المثلى من عملية التوليف. بالإضافة إلى ذلك، تماما مثل الأدوية، تعتمد الجسيمات النانوية على نماذج حيوانية للاختبار قبل الفحص لتحديد فعاليتها وسمياتها. النموذج الأكثر استخداما قبل الظهر هو الفأر، وهو الثدييات التي صيانة يأتي بتكلفة عالية نسبيا. لدراسات السرطان، أما الفئران المهندسة وراثيا أو الفئران xenografted تستخدم عادة6،7. وغالباً ما يمتد طول هذه التجارب من أسابيع إلى أشهر. على وجه الخصوص، لدراسات الانبثاث السرطانية، يتم حقن الخلايا السرطانية مباشرة في نظام الدورة الدموية للفئران في مواقع مثل الأوردة التيل والطحال8،9،10. هذه النماذج تمثل فقط المراحل النهائية من الانبثاث عندما الخلايا السرطانية البذخ واستعمار الأعضاء البعيدة. وعلاوة على ذلك، نظراً لقضايا الرؤية، فإنه من الصعب بشكل خاص رصد هجرة الخلايا السرطانية واستهداف الجسيمات النانوية للخلايا السرطانية في الفئران.
الحمار الوحشي (Danio rerio) أصبح نظام الفقاريات القوية لأبحاث السرطان بسبب برازها عالية ، منخفضة التكلفة ، التنمية السريعة ، والشفافية البصرية ، والحفاظ على الجينات11،12. ميزة أخرى للحمار الوحشي على نموذج الماوس هو تخصيب بيض السمك السابق الرحم ، والذي يسمح بمراقبة الأجنة طوال نموها. التطور الجنيني سريع في حمار وحشي، وخلال 24 ساعة postfertilization (hpf)، وقد شكلت بالفعل طائرة الجسم الفقاريات13. بواسطة 72 حصانا، يتم فقس البيض من الكورشي، والانتقال من مرحلة الجنين إلى مرحلة جمهورية يوغوسلافيا الاتحادية. الشفافية من الحمار الوحشي، وسلالة كاسبر في14على وجه الخصوص ، ويوفر فرصة فريدة لتصور هجرة الخلايا السرطانية والتعرف عليها واستهدافها من قبل الجسيمات النانوية في حي. وأخيرا، حمار وحشي تطوير جهاز المناعة الفطرية بنسبة 48 حصانا، مع نظام المناعة التكيفية متخلفة وتصبح وظيفية فقط في 28 يوما postfertilization15. هذه الفجوة الزمنية مثالية لزرع أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية البشرية في أجنة حمار وحشي دون أن تعاني من الرفض المناعي.
ويرد وصفها هنا هي الطريقة التي تستفيد من الشفافية والتطور السريع للحمار الوحشي لإثبات الاعتراف واستهداف الخلايا السرطانية البشرية من قبل الجسيمات النانوية الفلورية في الجسم الحي. في هذا الفحص، تم حقن خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (خلايا هيلا) المهندسة وراثيا للتعبير عن بروتين الفلورسنت الأحمر في منطقة الأوعية الدموية في تجويف ما حول حتمية من 48 جنينا حصانا. بعد 20-24 ساعة، خلايا هيلا قد انتشرت بالفعل في جميع أنحاء الأجنة من خلال نظام الدورة الدموية الأسماك. تم مضغ الأجنة ذات الانبثاث الظاهرة مع ~ 0.5 نانول من محلول الجسيمات النانوية خلف العين مباشرة ، حيث يقع السرير الشعري الغني. باستخدام هذه التقنية، يمكن للجسيمات النانوية السيليكا الفلورية فائقة الوضوح استهداف خلايا HeLa بسرعة 20-30 دقيقة بعد الحقن. نظرًا لبساطته وفعاليته، يمثل سمك الحمار الوحشي نموذجًا قويًا في الجسم الحي لاختبار مجموعة متنوعة من الجسيمات النانوية لقدرتها على استهداف خلايا سرطانية محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم حمار وحشي كنظام في الجسم الحي لاختبار قدرة الجسيمات النانوية على التعرف على الخلايا السرطانية البشرية النقيلي واستهدافها. يمكن أن تؤثر عدة عوامل على التنفيذ الناجح للتجارب. أولاً، تحتاج الأجنة إلى أن تكون متطورة بالكامل عند 48 حصاناً. المرحلة التنموية الصحي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون السيدة كيلي سميث، والسيدة لورين كوك، والسيد ألكسندر فلو على تدقيقها في قراءة المخطوطة. H.F. يعترف بدعم منحة من المعاهد القومية للصحة (CA134743 وCA215059)، وجمعية السرطان الأمريكية (RSG-17-204 01-TBG)، ومؤسسة سانت بالدريك. F.J.F.L. يعترف زمالة من جامعة بوسطن مركز الابتكار BUnano التدريب عبر التخصصات في تكنولوجيا النانو للسرطان (XTNC). I.S يعترف بدعم NSF (منحة CBET 1605405) وNIH R41AI142890.
Materials
| Agarose | KSE scientific | BMK-A1705 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1.0 mm O.D. x 0,78 mm | |
| Computer and monitor | ThinkCentre | X000335 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | 10-013-CV | sold by Fisher |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fish incubator | VWR | 35960-056 | |
| Hemocytometer | Fishersci brand | 02-671-51B | |
| Magnetic stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Microloader tip | Eppendorf | E5242956003 | sold by Fisher |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MMPI-3 | |
| Needle Puller | Sutter instruments | P-97 | |
| Olympus MVX-10 fluorescent microscope | Olympus | MVX-10 | |
| P200 tip | Fishersci brand | 07-200-293 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X) | Corning | 21-030-CV | sold by Fisher |
| Petri dish | Corning | SB93102 | sold by Fisher |
| Plastic pipette | Fishersci brand | 50-998-100 | |
| pLenti6.2_miRFP670 | Addgene | 13726 | |
| Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | SYSPV820 | |
| Pronase | Roche-Sigma-Fisher | 50-100-3275 | Roche product made by Sigma- sold by Fisher |
| Razor blade | Fishersci brand | 12-640 | |
| SZ51 dissection microscope | Olympus | SZ51 | |
| Tricaine methanesulfonate | Western Chemicals | NC0872873 | sold by Fisher |
| Trypsin-EDTA | Corning | MT25053CI | sold by Fisher |
| Tweezer | Fishersci brand | 12-000-122 |
References
- Dadwal, A., Baldi, A., Kumar Narang, R. Nanoparticles as carriers for drug delivery in cancer. Artificial Cells, Nanomedicine, Biotechnology. 46 (Suppl 2), 295-305 (2018).
- Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z. G., Shin, D. M. Therapeutic nanoparticles for drug delivery in cancer. Clinical Cancer Research. 14 (5), 1310-1316 (2008).
- Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Target Therapy. 3, 7 (2018).
- Chinen, A. B., et al. Nanoparticle Probes for the Detection of Cancer Biomarkers, Cells, and Tissues by Fluorescence. Chemal Reviews. 115 (19), 10530-10574 (2015).
- Palantavida, S., Guz, N. V., Woodworth, C. D., Sokolov, I. Ultrabright fluorescent mesoporous silica nanoparticles for prescreening of cervical cancer. Nanomedicine. 9 (8), 1255-1262 (2013).
- Singh, M., Murriel, C. L., Johnson, L. Genetically engineered mouse models: closing the gap between preclinical data and trial outcomes. Cancer Research. 72 (11), 2695-2700 (2012).
- Sharkey, F. E., Fogh, J. Considerations in the use of nude mice for cancer research. Cancer Metastasis Reviews. 3 (4), 341-360 (1984).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. Journal of Visualized Experiments. (91), e51677 (2014).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Liu, S., Leach, S. D. Zebrafish models for cancer. Annual Reviews in Pathology. 6, 71-93 (2011).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental and Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Westerfield, M. . THE ZEBRAFISH BOOK. , (2007).
- Anderson, N. M., et al. The TCA cycle transferase DLST is important for MYC-mediated leukemogenesis. Leukemia. 30 (6), 1365-1374 (2016).
- Peerzade, S., et al. Ultrabright fluorescent silica nanoparticles for in vivo targeting of xenografted human tumors and cancer cells in zebrafish. Nanoscale. 11 (46), 22316-22327 (2019).
- Peng, B., et al. Ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Materials Today (Kidlington). 23, 16-25 (2019).
- Peng, B., et al. Data on ultrabright fluorescent cellulose acetate nanoparticles for imaging tumors through systemic and topical applications. Data in Brief. 22, 383-391 (2019).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Rao, P. N., Engelberg, J. Hela Cells: Effects of Temperature on the Life Cycle. Science. 148 (3673), 1092-1094 (1965).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 83 (1), 13-34 (2008).
