In Vivo Målretting av Xenografted Human Cancer Celler med funksjonalisert fluorescerende silika nanopartikler i sebrafisk

Summary

Beskrevet her er en metode for å utnytte sebrafisk embryoer for å studere evnen til funksjonaliserte nanopartikler for å målrette menneskelige kreftceller in vivo. Denne metoden gjør det mulig å evaluering og valg av optimale nanopartikler for fremtidig testing hos store dyr og i kliniske studier.

Abstract

Utvikling av nanopartikler som er i stand til å oppdage, målrette og ødelegge kreftceller, er av stor interesse innen nanomedisin. In vivo dyremodeller er nødvendig for å bygge bro over nanoteknologien til sin biomedisinske applikasjon. Musen representerer den tradisjonelle dyremodellen for preklinisk testing; Imidlertid er mus relativt dyre å beholde og har lange eksperimentelle sykluser på grunn av begrenset avkom fra hver mor. Sebrafisken har dukket opp som et kraftig modellsystem for utviklings- og biomedisinsk forskning, inkludert kreftforskning. Spesielt på grunn av sin optiske gjennomsiktighet og raske utvikling, er sebrafiskembryoer godt egnet for sanntids in vivo overvåking av oppførselen til kreftceller og deres interaksjoner med deres mikromiljø. Denne metoden ble utviklet for å sekvensielt introdusere humane kreftceller og funksjonaliserte nanopartikler i gjennomsiktige Casper sebrafisk embryoer og overvåke in vivo anerkjennelse og målretting av kreftcellene ved nanopartikler i sanntid. Denne optimaliserte protokollen viser at fluorescerende merkede nanopartikler, som er funksjonalisert med folatgrupper, spesifikt kan gjenkjenne og målrette metastatiske humane livmorhalsepitelkreftceller merket med en annen fluorokrom. Anerkjennelse og målretting prosessen kan oppstå så tidlig som 30 min etterinjeksjon av nanopartikler testet. Hele eksperimentet krever bare avl av noen få par voksen fisk og tar mindre enn 4 dager å fullføre. Videre mangler sebrafiskembryoer et funksjonelt adaptivt immunsystem, slik at engraftment av et bredt spekter av menneskelige kreftceller. Derfor gjør nytten av protokollen som er beskrevet her, testing av nanopartikler på ulike typer humane kreftceller, noe som letter valg av optimale nanopartikler i hver bestemt kreftkontekst for fremtidig testing hos pattedyr og klinikken.

Introduction

Utviklingen av nanopartikler som er i stand til å oppdage, målrette og ødelegge kreftceller er av stor interesse for både fysikere og biomedisinske forskere. Fremveksten av nanomedisin førte til utvikling av flere nanopartikler, for eksempel de som konjugert med målretting av ligander og / eller kjemoterapeutiske legemidler^1,2,3. De ekstra egenskapene til nanopartikler muliggjør deres interaksjon med det biologiske systemet, sensing og overvåking av biologiske hendelser med høy effektivitet og nøyaktighet sammen med terapeutiske applikasjoner. Gull og jernoksid nanopartikler brukes hovedsakelig i computertomografi og magnetisk resonans imaging applikasjoner, henholdsvis. Mens de enzymatiske aktivitetene til gull- og jernoksidnanopartikler tillater påvisning av kreftceller gjennom kolorimetriske analyser, er fluorescerende nanopartikler godt egnet for in vivobildeapplikasjoner⁴. Blant dem er ultrahøye fluorescerende nanopartikler spesielt gunstige, på grunn av deres evne til å oppdage kreft tidlig med færre partikler og redusert toksisitet⁵.

Til tross for disse fordelene krever nanopartikler eksperimentering ved hjelp av in vivo dyremodeller for valg av egnede nanomaterialer og optimalisering av synteseprosessen. I tillegg, akkurat som narkotika, nanopartikler stole på dyremodeller for preklinisk testing for å bestemme deres effekt og toksisitet. Den mest brukte prekliniske modellen er musen, som er et pattedyr hvis vedlikehold kommer til en relativt høy pris. For kreftstudier brukes vanligvis enten genmodifiserte mus eller xenografted mus^6,7. Lengden på disse eksperimentene strekker seg ofte fra uker til måneder. Spesielt for kreftmetastasestudier injiseres kreftceller direkte i musenes sirkulasjonssystem på steder som haleårer og milt^8,,9,,10. Disse modellene representerer bare sluttfasen av metastase når tumorceller ekstravasate og kolonisere fjerne organer. Videre, på grunn av synlighetsproblemer, er det spesielt utfordrende å overvåke tumorcellemigrasjon og nanopartikkelmålretting av tumorceller hos mus.

Sebrafisken (Danio rerio) har blitt et kraftig virveldyrsystem for kreftforskning på grunn av sin høye fecundity, lave kostnader, rask utvikling, optisk åpenhet og genetiske^{bevaringer 11,12}. En annen fordel med sebrafisken over musemodellen er befruktningen av fiskeeggene ex utero, noe som gjør at embryoene kan overvåkes gjennom hele utviklingen. Embryonisk utvikling er rask i sebrafisk, og innen 24 timer etter befruktning (hpf), har virveldyrkroppsplanet allerede dannet¹³. Ved 72 hk klekket egg fra chorion, og går fra embryonale til yngelstadiet. Gjennomsiktigheten av sebrafisk, Casper belastning spesielt^14,gir en unik mulighet til å visualisere migrering av kreftceller og deres anerkjennelse og målretting av nanopartikler i et levende dyr. Til slutt utvikler sebrafisk sitt medfødte immunsystem med 48 hkf, med det adaptive immunsystemet som henger etter og bare blir funksjonell ved 28 dager etter befruktning¹⁵. Denne gangen gapet er ideelt for transplantasjon av ulike typer menneskelige kreftceller i sebrafisk embryoer uten å oppleve immunavstøt.

Beskrevet her er en metode som utnytter gjennomsiktighet og rask utvikling av sebrafisk for å demonstrere anerkjennelse og målretting av menneskelige kreftceller ved fluorescerende nanopartikler in vivo. I denne analysen ble humane livmorhalskreftceller (HeLa-celler) genetisk konstruert for å uttrykke et rødt fluorescerende protein injisert i det vaskulariserte området i perivitellinhulen til 48 hpf embryoer. Etter 20-24 timer hadde HeLa-cellene allerede spredt seg gjennom embryoene gjennom fiskesirkulasjonssystemet. Embryoer med tilsynelatende metastase ble mikroinjisert med ~ 0,5 nL av en nanopartikkelløsning rett bak øyet, hvor den rike kapillærsengen ligger. Ved hjelp av denne teknikken kan de ultrahøye fluorescerende silikananopartikler målrette HeLa-celler så raskt som 20-30 min postinjeksjon. På grunn av sin enkelhet og effektivitet representerer sebrafisken en robust in vivo-modell for å teste en rekke nanopartikler for deres evne til å målrette mot bestemte kreftceller.

Protocol

Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston University School of Medicine under protokollen #: PROTO201800543. 1. Generasjon av Casper sebrafisk embryoer Velg voksen Casper fisk som er minst 3 måneder for naturlig avl for å generere gjennomsiktige Casper sebrafisk embryoer. Fyll to-kammer parring tanker med fiskevann om kvelden, skille de øvre tankene ved hjelp av skillevegger, plasser en m…

Representative Results

Protokollen skjematisk i figur 1 illustrerer de generelle prosedyrene for denne studien. Gjennomsiktig Casper mannlig og kvinnelig voksen fisk ble avlet for å generere embryoer (avsnitt 1). RFP+ HeLa-celler ble injisert i det vaskulariserte området under perivitellinhulen til sebrafiskembryoene ved 48 hkf, med uinjiserte embryoer som kontroller (avsnitt 3). For personer som opplever mikroinjeksjon, er overlevelsesraten av embryoer ofte høy, med mi…

Discussion

Protokollen som er beskrevet her benytter sebrafisk som et in vivo-system for å teste nanopartiklers evne til å gjenkjenne og målrette metastatiske humane kreftceller. Flere faktorer kan påvirke vellykket gjennomføring av eksperimentene. Først må embryoer være fullt utviklet ved 48 hkf. Den riktige utviklingsstadiet av embryoene gjør dem i stand til å tåle og overleve transplantasjon av menneskelige kreftceller. Embryoer yngre enn 48 hkf har en betydelig lavere overlevelse sammenlignet med eldre og mer utvikle…

Materials

Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122