Y-27632 丰富成人皮肤组织中人类黑色素细胞的产量
Summary
本文报告，在TIVA培养基中加入Y-27632可以显著提高成人皮肤组织中黑色素细胞的产生。
Abstract
原发性黑色素细胞与皮肤组织的分离和培养在生物研究中非常重要，已广泛应用于临床应用。通过传统方法从皮肤组织中隔离原发性黑色素细胞通常需要大约 3 到 4 周才能充分通过。更重要的是，使用的组织通常是新生儿前皮，从成人组织中有效分离原发性黑色素细胞仍然是一个挑战。我们最近开发了一种新的黑色素细胞分离方法，将Y-27632（一种Rho激酶抑制剂）添加到初始培养基48小时。 与常规方案相比，这种新方法显著提高了黑色素细胞的产量，缩短了从前皮组织中分离黑色素细胞的时间。我们现在更详细地描述这种新方法，使用成人表皮来有效地培养原发性黑色素细胞。重要的是，我们表明，从这种新方法编写的成人组织中获得的黑色素细胞可以正常工作。这一新协议将显著有利于研究色素沉着缺陷黑色素瘤使用原发性黑色素细胞准备从容易访问的成人皮肤组织。
Introduction
本研究的目标是开发一种简单有效的方案，将黑色素细胞从成人皮肤的表皮中分离，用于生物研究和临床应用。黑色素细胞位于皮肤和毛囊的基底表皮中，通过产生黑色素1，在皮肤和头发色素沉着中发挥重要作用。表皮黑色素细胞产生的皮肤色素沉着作为紫外线辐射过滤器，减少/防止DNA损伤皮肤基础细胞2。黑色素细胞在皮肤中的异常增殖是很常见的，例如在良性neve（摩尔）的形成中，其中黑色素细胞有可能转化为致癌生长，然后是细胞衰老3。
自1957年以来，人类原发性黑色素细胞的分离和随后的培养已经成为可能4，但自1982年以来，才有一种有效的方法，可以从表皮5中重现人类黑色素细胞的培养。将原发性黑色素细胞与表皮分离的传统方法涉及两步酶消化。简言之，皮肤最初被消化与脱皮，以分离表皮从真皮，然后表皮消化与三普辛产生悬浮液含有黑色素细胞和角蛋白细胞，然后可以有选择地生长在不同的介质。目前，初始培养通常需要大约3至4周的时间，黑色素细胞使用传统方法达到汇合，这很可能是由于它们的分离效率低。因此，增加成人皮肤组织最初生产的黑色素细胞对实验室研究和临床应用都很有帮助。
许多生长因子，其中多数已被证明由角蛋白细胞分泌（例如，+-MSH，ACTH，bFGF，NGF，ET-1，GM-CSF，HGF，LIF和SCF）5-8，调节哺乳动物黑色5–8素细胞的分化和增殖。在没有喂食层的情况下，缺乏这些生长因子导致黑色素细胞的增殖减少，其凋亡增加9。角蛋白细胞作为馈生细胞和黑色素细胞的共培养可导致黑色素细胞增殖加速和凋亡减少。然而，共培养方法不仅需要更多的皮肤组织来准备角蛋白细胞，这是不实际的，但也不有效工作，因为黑色素细胞所需的培养条件不偏向角蛋白细胞生长，反之亦然。
先前的研究已经报道，将Y-27632，一种 ROCK抑制剂，加入生长介质，可以提高人类原发性表皮细胞从皮肤组织10-14–的产量。因此，测试人类原发性黑色素细胞的分离是否会受益于Y-27632的存在是很有趣的。事实上，Y-27632加入接种TIVA介质15，其中含有TPA，IBMX，Na3VO4和3dbcAMP，显著提高了4原发性黑色素细胞在初始培养体16中从包皮组织分离的产量。与传统协议相比，这种新协议在提高黑色素细胞16的产量方面效率显著提高。因此，本协议在此前的研究16的基础上，详细描述了使用成人皮肤组织的新方法，以促进其在基础和应用生物学研究中的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议是基于最近的出版物16。应注意以下关键步骤，以便采用新方法获得最佳效果。首先，成功分离表皮和真皮至关重要。使用手术刀刀片将成人的外皮组织切成 3-4 mm 宽的条，使脱毛工作更彻底、更容易地将表皮与真皮分离。其次，在分离这两层时，应避免真皮污染，因为皮肤纤维细胞也可以生长在黑色素细胞培养基中。第三，三是消化步骤应小于30分钟;否则，它会…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家国家重点研究发展计划（2017YFA0104604）、国家自然科学基金总计划（81772093）、军事后勤研究项目（AWS17J005）、山东省自然科学基金重点项目（ZR2019ZD3）的支持。 6）和山东省重点研究发展计划（2019GSF108107）至X.W.广东基础与应用基础研究基金会（2019A1515110833）和山东大学基础研究基金（2019GN043）至J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
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