Y-27632 מעשיר את התשואה של מלנוציטים אנושיים מרקמות עור למבוגרים
Summary
נייר זה מדווח כי התוספת של Y-27632 כדי בינונית הגוף יכול להגדיל באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים.
Abstract
הבידוד והתרבות של מלנוציטים הראשי מרקמות העור הוא מאוד חשוב עבור מחקר ביולוגי השתמשו באופן נרחב עבור יישומים קליניים. בידוד מלנוציטים הראשי מרקמות העור על ידי השיטה המקובלת בדרך כלל לוקח כ 3 עד 4 שבועות למעבר מספיק. חשוב יותר, הרקמות המשמשות בדרך כלל היילוד עורלות וזה עדיין אתגר כדי לבודד ביעילות מלנוציטים הראשי מרקמות למבוגרים. פיתחנו לאחרונה שיטת בידוד חדשה עבור מלנוציטים המוסיפה Y-27632, מעכבי Rho קינאז, למדיום התרבות הראשונית עבור 48 h. לעומת הפרוטוקול המקובל, זו שיטה חדשה מגדילה באופן דרמטי את התשואה של מלנוציטים ומקצרת את הזמן הנדרש כדי לבודד מלנוציטים מרקמות העורלה. עכשיו אנחנו מתארים את השיטה החדשה הזאת בפירוט רב יותר באמצעות אפידרמיס למבוגרים לתרבות ביעילות מלנוציטים הראשי. חשוב מכך, אנו מראים כי מלנוציטים שהתקבלו מרקמות למבוגרים שהוכנו על ידי שיטה חדשה זו יכולה לתפקד כרגיל. פרוטוקול חדש זה יועיל באופן משמעותי למחקרים של פגמים פיגמנטציה ומלנומה באמצעות מלנוציטים הראשי מוכן בקלות לגשת רקמות עור למבוגרים.
Introduction
המטרה של מחקר זה היה לפתח פרוטוקול פשוט ואפקטיבי כדי לבודד מלנוציטים מן האפידרמיס של העור המבוגר למחקר ביולוגי ויישומים קליניים. מלנוציטים, אשר ממוקמים באפידרמיס הבזליים של העור ובזקיקי השיער, לשחק תפקיד חשוב בפיגמנטציה של העור והשיער על ידי הפקת מלנין1. העור שנוצר פיגמנטציה מתוך מלנומה באפידרמיס מעשים כמו מסנן קרינה אולטרה סגולה המפחית/מונע נזק DNA לתאים הבסיסיים בעור2. התפשטות חריגה של מלנוציטים בעור הוא די נפוץ, כמו בהיווצרות nevi שפיר (שומות) שבו מלנוציטים בפוטנציאל להפוך לצמיחה אונגניים ואחריו הזדקנות הסלולר3.
מאז 1957, הבידוד והתרבות הבאה של מלנוציטים הראשי האנושי היה אפשרי4, אבל רק מאז 1982 יש כבר שיטה יעילה שיכולה ליצור תרבויות של מלנוציטים אנושייםמתוךהאפידרמיס 5. השיטה המקובלת לבודד מלנוציטים הראשי מתוך האפידרמיס כרוכה בעיכול שני שלבים אנזימטיות. בקצרה, העור מתעכל בתחילה עם בעיות כדי להפריד את האפידרמיס מן dermis, לאחר שאפידרמיס מתעכל עם טריפסין לייצר השעיות המכילות מלנוציטים ו keratinocytes, אשר יכול להיות באופן סלקטיבי גדל במדיה שונים. כיום, התרבות הראשונית אורכת בדרך כלל 3 עד 4 שבועות עבור מלנוציטים כדי להגיע לשטף באמצעות השיטה המקובלת, אשר צפוי בשל היעילות הנמוכה של הבידוד שלהם. לכן, הגדלת הייצור הראשוני של מלנוציטים מרקמות העור למבוגרים יהיה מועיל למדי עבור שני מחקר מעבדה ויישומים קליניים.
גורמי גדילה רבים, שרובם הוכחו להיות מופרש על ידי keratinocytes (למשל, α-msh, acth, bfgf, ngf, ET-1, GM-שדרתי, hgf, אבל scf)5–8, להסדיר את הבידול והתפשטות של מלנוציטים היונקים. בהיעדר שכבות ממזין, חוסר גורמי גדילה אלה מוביל את התפשטות ירידה של מלנוציטים ואפופטוזיס מוגברת שלהם9. שיתוף התרבות של keratinocytes כמו תאים מאכיל ומלנוציטים עלול להוביל להאצת מלנוציט התפשטות ואפופטוזיס מופחת. עם זאת, שיטת שיתוף התרבות לא רק דורש רקמות העור יותר כדי להכין keratinocytes, אשר אינו מעשי, אבל גם לא יכול לעבוד ביעילות כי תנאי התרבות הנדרשים על ידי מלנוציטים אינו מעדיף צמיחה keratinocytes, ולהיפך.
מחקרים קודמים דיווחו כי תוספת של Y-27632, מעכב סלע, לתוך המדיום צמיחה יכול לשפר את התשואה של התאים האנושיים באפידרמיס העיקרי מרקמות העור10–14. לכן, זה יהיה מעניין לבדוק אם הבידוד של המלנוציטים הראשי האנושי יועיל מנוכחותם של Y-27632. אכן, תוספת של Y-27632 לתוך בינונית החיסון15, אשר מכיל הסברתי, Ibmx, Na3VO4 ו dbcamp, הגדילה באופן משמעותי את התשואה של מלנוציטים הראשי מבודד רקמות העורלה בתרבויות הראשוניות16. בהשוואה לפרוטוקול המקובל, פרוטוקול חדש זה הוא יעיל יותר באופן משמעותי בהגדלת התשואה של מלנוציטים16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את השיטה החדשה בפירוט באמצעות רקמות עור למבוגרים המבוססות על מחקר קודם16 על מנת לקדם את יישומו במחקר ביולוגי בסיסי ומיושם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן התבסס על פרסום16שנערך לאחרונה. יש לשלם תשומת לב מסוימת לשלבים הקריטיים הבאים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר בשיטה החדשה. ראשית, הפרדה מוצלחת של האפידרמיס והדרמיס היא חיונית. חותכים את הרקמות העורלה למבוגרים לתוך 3-4 mm רצועות רחב באמצעות להב אזמל כדי להפו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (2017YFA0104604), התוכנית הכללית של הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (81772093), פרויקט מחקר לוגיסטיקה צבאית (AWS17J005), התוכנית המפתח של מחוז שאנדונג המדע הטבעי הקרן (ZR2019ZD36) ואת מחקר מפתח תוכנית פיתוח של מחוז שאנדונג (2019GSF108107) כדי X.W. גואנג-דונג בסיסי מחקר היסוד (2019A1515110833) ואת קרנות המחקר הבסיסי של אוניברסיטת שאנדונג (2019GN043) ל J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
