Y-27632 Yetişkin Cilt Dokularından İnsan Melanositlerin Verimini Zenginleştirir
Summary
Bu makale, Y-27632’nin TIVA ortamına eklenmesinin yetişkin cilt dokularından melanosit lerin verimini önemli ölçüde artırabileceğini bildiriyor.
Abstract
Deri dokularından birincil melanositlerin izolasyonu ve kültürü biyolojik araştırmalar için çok önemlidir ve klinik uygulamalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. Geleneksel yöntemle deri dokularından birincil melanositizole genellikle yeterince geçmesi yaklaşık 3-4 hafta sürer. Daha da önemlisi, kullanılan dokular genellikle yenidoğan sünnet derisi ve hala verimli yetişkin dokulardan primer melanosit izole etmek için bir meydan okumadır. Yakın zamanda, rho kiril inhibitörü olan Y-27632’yi geleneksel protokolle karşılaştırıldığında ilk kültür ortamına ekleyen melanositler için yeni bir izolasyon yöntemi geliştirdik, bu yeni yöntem melanositlerin verimini önemli ölçüde artırır ve sünnet derisi dokularından melanositleri izole etmek için gereken süreyi kısaltır. Şimdi bu yeni yöntemi daha ayrıntılı olarak yetişkin epidermis kullanarak verimli bir şekilde birincil melanosit kültür açıklar. Daha da önemlisi, bu yeni yöntemle hazırlanan erişkin dokulardan elde edilen melanositlerin normal şekilde çalışabildiği gösterilebilir. Bu yeni protokol, kolayca erişilen erişilen erişilen erişilen erişilen erişilen cilt dokularından hazırlanan primer melanositler kullanılarak pigmentasyon defektleri ve melanomların çalışmalarına önemli ölçüde fayda sağlayacaktır.
Introduction
Bu çalışmanın amacı, biyolojik araştırma ve klinik uygulamalar için yetişkin cildin epidermisinden melanositleri izole etmek için basit ve etkili bir protokol geliştirmektir. Cildin bazal epidermisinde ve saç foliküllerinde bulunan melanositler,melanin1 üreterek cilt ve saç pigmentasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Epidermal melanositlerden elde edilen deri pigmentasyonu, derideki altta yatan hücrelere DNA hasarını azaltan/engelleyen ultraviyole radyasyon filtresi görevi görür2. Deride melanositlerin anormal çoğalması oldukça yaygındır, benign nevüs oluşumu gibi (benler) hangi melanositler potansiyel olarak onkojenik3büyümeye dönüştürmek hücresel senescence 3 .
1957 yılından bu yana, izolasyon ve insan birincil melanosit sonraki kültür mümkün olmuştur4, ama sadece 1982 yılından bu yana tekrar tekrar epidermisin insan melanosit kültürleri kurmak etkili bir yöntem olmuştur5. Primer melanositleri epidermisten izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem iki aşamalı enzimatik sindirim gerektirir. Kısaca, cilt başlangıçta dermis epidermisini ayırmak için dispase ile sindirilir, daha sonra epidermisin tripsin ile sindirilir melanosit ler ve keratinositler içeren süspansiyonlar üretmek için, daha sonra seçici olarak farklı medyada yetiştirilebilir. Şu anda, ilk kültür genellikle melanositler için geleneksel yöntem kullanarak biraraya ulaşmak için yaklaşık 3-4 hafta sürer, hangi izolasyon düşük verimlilik nedeniyle muhtemeldir. Bu nedenle, yetişkin cilt dokularından melanosit ilk üretimini artırmak hem laboratuvar araştırmaları hem de klinik uygulamalar için oldukça yararlı olacaktır.
Çoğu keratinositler (örneğin, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF SCF ve LIF SCF) tarafından salgılandığı gösterilen birçok büyümefaktörü,–8memeli melanositlerin farklılaşmasını ve çoğalmasını düzenler. Besleyici tabakaların yokluğunda, bu büyüme faktörlerinin eksikliği melanositlerin çoğalmasına ve artan apoptozun azalmasına yol açar9. Besleyici hücreler ve melanositler olarak keratinositlerin ortak kültürü hızlandırılmış melanosit çoğalmasına ve azaltılmış apoptosisyol açabilir. Ancak, co-kültür yöntemi sadece pratik değildir keratinositler hazırlamak için daha fazla cilt dokuları talep değil, ama aynı zamanda melanositlerin gerektirdiği kültür koşulları keratinosit büyüme lehine değildir, çünkü verimli çalışamadı, ve tersi.
Önceki çalışmalarda Y-27632 eklenmesi, bir ROCK inhibitörü, büyüme ortamına cilt dokularından insan birincil epidermal hücrelerinin verimini artırabilir bildirdin10–14. Bu nedenle, insan birincil melanosit izolasyon Y-27632 varlığından yarar olup olmadığını test etmek ilginç olacaktır. Nitekim, Y-27632 eklenmesi aşı TIVA ortaiçine 15, Hangi TPA içeren, IBMX, Na3VO4 ve dbcAMP, önemli ölçüde ilk kültürlerde sünnet derisi dokulardan izole birincil melanosit lerin verimi arttı16. Konvansiyonel protokol ile karşılaştırıldığında, bu yeni protokol melanosit16verimini artırmada önemli ölçüde daha verimlidir. Bu nedenle, bu protokol, temel ve uygulamalı biyolojik araştırmalarda uygulanmasını teşvik etmek amacıyla bir önceki çalışma16 dayalı yetişkin cilt dokuları kullanarak ayrıntılı olarak yeni yöntem açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol yeni bir yayın16dayanmaktadır. Yeni yöntemle en iyi sonuçları elde etmek için aşağıdaki kritik adımlara dikkat edilmelidir. İlk olarak, epidermis ve dermis başarılı ayrılması çok önemlidir. Dermis epidermisini ayırmak için neşterin daha ayrıntılı ve kolay çalışmasını sağlamak için neşter bıçağı kullanarak yetişkin sünnet derisi dokularını 3-4 mm genişliğinde şeritler halinde kesin. İkinci olarak, bu iki tabakayı ayırırken d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0104604), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Genel Programı (81772093), Askeri Lojistik Araştırma Projesi (AWS17J005), Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı tarafından desteklenmiştir. ) ve Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) X.W. Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2019A1515110833) ve Shandong Üniversitesi Temel Araştırma Fonları (2019GN043) J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
