رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد
Summary
النهج المقدم في وقت واحد يقيم غزو الخلايا السرطانية في 3D مقايسات كروية وT-خلية السمية الخلوية. يتم إنشاء Spheroids في جبيرة agarose متعددة microwell خالية من السقالات. يتم تنفيذ ثقافة المشاركة والتضمين في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل نفس الجهاز الذي يسمح بمراقبة غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية بوساطة T-cell.
Abstract
وقد أحرز تقدم كبير في علاج السرطان بالعلاج المناعي، على الرغم من أن عددا كبيرا من أنواع السرطان لا يزال مقاوما للعلاج. وهناك عدد محدود من المقايسات تسمح للرصد المباشر والرؤى الميكانيكية في التفاعلات بين الخلايا السرطانية والمناعة, من بينها, الخلايا التائية تلعب دورا هاما في تنفيذ استجابة السامة للخلايا من الجهاز المناعي التكيفي للخلايا السرطانية. وتستند معظم المقايسات على ثنائي الأبعاد (2D) ثقافة المشتركة للخلايا بسبب سهولة الاستخدام النسبي ولكن مع تمثيل محدود من النمط الظاهري النمو الغازية، واحدة من السمات المميزة للخلايا السرطانية. تتطلب أنظمة الثقافة المشتركة (ثلاثية الأبعاد) الحالية إما معدات خاصة أو مراقبة منفصلة لغزو الخلايا السرطانية المشتركة في الثقافة والخلايا التائية المتفاعلة.
هنا وصفنا نهجا لرصد السلوك في وقت واحد الغازية في 3D من الخلايا السرطانية spheroids وT-خلية السمية الخلوية في الثقافة المشتركة. يتم دفع تشكيل Spheroid من خلال تفاعلات الخلايا المعززة في يلقي agarose microwell خالية من السقالات مع قيعان على شكل حرف U. يتم تنفيذ كل من الخلايا التائية المشتركة في الثقافة وغزو الخلايا السرطانية في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول داخل microwells من يلقي agarose دون الحاجة إلى نقل الخلايا ، وبالتالي الحفاظ على نظام الثقافة المشتركة 3D سليمة في جميع أنحاء الفحص. يمكن فصل مصفوفة الكولاجين عن يلقي agarose، مما يسمح للflufluorescence (IF) تلطيخ وللتصوير confocal من الخلايا. أيضا، يمكن عزل الخلايا لمزيد من النمو أو تخضع لتحليلات مثل التعبير الجيني أو الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS). وأخيرا، يمكن تحليل 3D المشتركة في الثقافة بواسطة الكيمياء المناعية (IHC) بعد تضمين والقطع. وتشمل التعديلات المحتملة للم مقايسة التراكيب المعدلة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وكذلك إدراج الخلايا القوية أو المناعية المختلفة مع الخلايا السرطانية.
Introduction
على الرغم من التحسينات الكبيرة في العلاج المناعي للسرطان على مدى العقد الماضي، فهمنا الميكانيكي للحساسية ومقاومة العلاجات لا تزال سيئة إلى حد ما1. ومن الثابت أن الأورام عرض عدم التجانس كبيرة, وأن التفاعلات الديناميكية للخلايا الورم مع البيئة الدقيقة وكذلك مع الخلايا المناعية, أثر الورم موت الخلايا, سلوك الغازية والاستجابة للعلاجات التي تشمل العلاج المناعي1,2,3. كذراع واحدة من الجهاز المناعي التكيفي، T-الخلايا تنفيذ السمية الخلوية الخاصة بالخلايا. تحليل التعرف على الخلايا التائية والاستجابة للخلايا السرطانية يوفر رؤى ميكانيكية في المقاومة والحساسية للعلاجات المتغيرة المناعية.
في المختبر النمذجة ورصد التفاعلات بين السرطان والخلايا التائية في بيئة مناسبة كانت صعبة وحتى الآن، أدى إلى رؤى ميكانيكية محدودة. تعتمد معظم المقايسات المستندة إلى الخلية على بيئة ثنائية الأبعاد، أن يفتقر إلى الميزات الرئيسية التي تعتبر حاسمة لتلخيص ثلاثي الأبعاد (3D) في علم وظائف الأعضاء الجسم الحي4,5,6, وهي التفاعلات الخلية المكانية, الاتصال مع مصفوفة خارج الخلية (ECM)7, الطلب الأيضي الديناميكي, زيادة نقص الأكسجة بسبب النمو الشامل8, وآثار الورم microenvironment (TME)9. من ناحية أخرى ، لا يزال هناك عدد من أوجه القصور مع استخدام حاليا ثلاثي الأبعاد (3D) نظم التحليل المشترك والغزو : (1) طبيعة تستغرق وقتا طويلا من الجيل spheroid والحصاد5،10، (2) عدم وجود سيطرة على حجم spheroid ، الشكل وكثافة الخلية11،12، (3) اختبار نوع منخفض الإنتاجية ، (4) متطلبات المعدات الخاصة13،14، (5) الحاجة إلى نقل الثقافة المشتركة إلى بيئات متميزة لمقاسات مختلفة15،16،17. على وجه الخصوص، نقل مقايسة الثقافة المشتركة غالبا ما يؤدي إلى تعطيل spheroids وفقدان النزاهة في الثقافة المشتركة. وهذا ينطبق خصوصا على spheroids “فضفاضة” مع انخفاض خلية الخلية التصاق. على سبيل المثال، تتطلب معظم عمليات فحص الغزو ثلاثي الأبعاد أن يتم حصاد الـ spheroids بعد تكوينها الأولي ثم إعادة الاعتماد عليها في ECM14،15،16. تؤدي خطوة إعادة التدهور هذه إلى فقدان التحكم في المسافة بين الـ spheroids. منذ المسافة بين الورم spheroids يؤثر على سلوكهم الغازية, هذا فقدان السيطرة يدخل التباين بين التشايس عالية ويقلل من إعادة إنتاج. وعلاوة على ذلك، فإن تطبيق مقايسات تجزئة الخلية من قبل خطوات الطرد المركزي المتتالية لتقييم الخلايا المناعية الطرفية والورمية المتسللة تقتصر على مجموعات الخلايا السرطانية التي تولد17spheroids أكثر استقرارا .
المفهوم والنهج
نهجنا يعالج أوجه القصور المذكورة أعلاه باستخدام “الكل في واحد” – 3D spheroid شارك ثقافة النموذج ، الذي لا يتطلب نقل spheroids لمقايسات لاحقة. نحن تكييفها جهاز تشكيل spheroid (انظر جدول المواد)لتوليد مقايسة لرصد في وقت واحد السلوك الغازية للخلايا السرطانية والسمية الخلوية من الخلايا التائية المشتركة في الثقافة. هذه الطريقة سهلة الاستخدام وغير مكلفة وتسمح بالتعامل السريع والسهل في إعداد ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية نسبيًا. تعتمد على نوع الجهاز المستخدم، يمكن إنشاء ما يصل إلى 81 من الـ 81 من الـ 777 1777 كبيرة الحجم بشكل موحد في خطوة واحدة من الأنابيب مع التحكم في حجم الزفير الفردي عن طريق تعديل عدد الخلايا المصنفة. يتم فرض تشكيل Spheroid من خلال تفاعلات الخلايا المعززة في أغروز متعددة الآبار الخالية من السقالات مع قيعان على شكل حرف U. نحن تكييف هذا النظام 3D لديناميكية الخلايا القائمة على الدراسات الوظيفية وكذلك نقطة النهاية الجزيئية والبيوكيميائية المقايسة التي تشمل الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS)، immunofluorescence (IF) أو مناعية الكيمياء (IHC) تلطيخ فضلا عن تحليل التعبير الجيني من سليمة 3D المشتركة الثقافة.
للدراسات وظيفية، والتضمين spheroids في نوع الكولاجين الأول داخل agarose يلقي النتائج في غزو الخلايا السرطانية من spheroids متساوية البعد وتصاريح رصد السمات الأساسية خط الخلية محددة ، مثل خلية واحدة مقابل الهجرة الجماعية خلية18،19. وعلاوة على ذلك، يتم فصل مصفوفة الكولاجين بسهولة من يلقي agarose، مما أدى إلى رقعة سميكة 1\u20122 مم تحتوي على spheroids متعددة، والتي يمكن معالجتها كذلك ل-تلطيخ IF والتصوير عن طريق المجهر confocal. وهذا يمكن أن تكشف عن اختراق الخلية وتفاعلات مصفوفة الخلية في فحص عالي الإنتاجية. أيضا، يمكن عزل الخلايا في مصفوفة الكولاجين بعد هضم الكولاجين وتفكك الخلايا المفردة لزراعة الخلايا أو التحليل اللاحق.
لتحليل IHC من spheroids، بعد التثبيت والقسم من أغاروز يلقي والبروتينات أو غيرها من الجزيئات ذات الاهتمام يمكن الكشف عنها مع الحفاظ على المواقع الجغرافية للpheroids. في النهج الموصوف هنا ، يتم تضمين spheroids مباشرة في هلام معالجة Hydroxyethyl agarose داخل يلقي agarose وهليل بمثابة “غطاء” للاحتفاظ spheroids في الجزء السفلي من microwells. بعد تضمين البارافين من أغاروز يلقي20, يتم تنفيذ المقطع الأفقي التسلسلي مع الجزء السفلي من المدلى بها بمثابة نقطة البداية.
هذا النهج يتناقض مع التشكيلات التقليدية IHC من spheroids التي تتطلب حصاد الخلايا قبل تضمينها في هيدروكسيثيل agarose معالجة هلام21 ، وخطر تعطيل spheroids وبالتالي فقدان الترتيب المكاني للخلايا. أيضا، يتم تجنب تجزئة الخلية عن طريق الطرد المركزي لتقييم ما إذا كانت الخلايا المناعية تسللت أو ظلت هامشية لpheroids الورم17 عن طريق تضمين مباشرة.
وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ 3D المشتركة الثقافة عن طريق دمج الورم، stromal أو الخلايا المناعية، وبالتالي دراسة الخلايا الورم عبر الحديث أو تلخيص مختلف الأورام microenvirments لتحليل التفاعلات الخلية الخلية بما في ذلك الثقافات المشتركة مع الخلايا البطانية16.
يمكن استخدام هذا الإعداد 3D شارك في الثقافة spheroid لتنفيذ ثقافة المشاركة من أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في البيئة الدقيقة الورم وتقييم آثار عناصر ECM المعدلة. بالإضافة إلى نوع الكولاجين الأول، مكونات ECM الأخرى (على سبيل المثال، matrigel، ماتريجل / الكولاجين الخلائط، فيبرومينكتين)، ويمكن استخدامها منذ غزو الخلايا الورم يتأثر وفرة ركائز مختلفة22. أيضا، microwells من الزهر agarose هي مناسبة لتشكيل spheroid من خطوط الخلايا الأولية وللخلايا مع انخفاض خلية الخلية التصاق.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المعروضة هنا تصف التوليد ثلاثي الأبعاد للورم، والذي يسمح بزرع الخلايا التائية، والتحاليل الوظيفية والجزيئية القائمة على الخلايا، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من إمكانيات الرصد والتحليل باستخدام جهاز واحد. الميزة الرئيسية لنهجنا هو أنه لا يتطلب نقل ثقافة 3D إلى فحص منفصل ويحافظ عل?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر فيرجيني أوري، دكتوراه لمناقشات مفيدة والمشورة حول نهج نموذج الثقافة المشتركة 3D. كما نشكر إليزابيث جونز على المساعدة التقنية الممتازة في قسم IHC. وقد دعمت هذه الدراسة من خلال المنح المقدمة من DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) إلى YL (LI 2547/4-1) والمعاهد الوطنية للصحة إلى AW (R01 CA2 31291)، إلى ATR (R01 CA205632)، إلى GWP (R01 CA218670)، والمنح الأساسية لمركز السرطان (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
- Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
- Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
- Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
- Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
- Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
- Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
- Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
- Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
- Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen’s RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, (2019).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
