ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D
Summary
הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.
Abstract
התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול בסרטן עם אימונותרפיה, למרות מספר רב של סוגי סרטן להישאר עמידים לטיפול. מספר מוגבל של אסות מאפשרות ניטור ישיר ותובנות מכניות על האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי מערכת החיסון, ביניהם, T-תאים לשחק תפקיד משמעותי בביצוע התגובה cytotoxic של המערכת החיסונית אדפטיבית לתאים סרטניים. רוב ההתאסות מבוססות על דו מימדי (2D) שיתוף תרבות של תאים בשל קלות השימוש היחסית, אבל עם ייצוג מוגבל של פנוטיפ צמיחה פולשנית, אחד סימני ההיכר של תאים סרטניים. מערכות שיתוף תרבויות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נוכחיות דורשות ציוד מיוחד או ניטור נפרד לפלישה לתאים סרטניים בעלי תרבות שיתופית ולאינטראקציה עם תאי T.
כאן אנו מתארים גישה כדי לפקח בו זמנית על התנהגות פולשנית ב3D של כדורי תאים סרטניים וcytotoxicity T-cell בתרבות השותפות. היווצרות ספרואיד מונעת על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בדגומים ללא אגרוז microwell יצוקות עם תחתיות בצורת U. הן T-cell שיתוף-תרבות ופלישה לתאים סרטניים לסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך microwells של יציקות agarose ללא צורך להעביר את התאים, ובכך שמירה על מערכת 3D שלם שיתוף תרבות לאורך כל ההסכם. ניתן להפריד את מטריצת הקולגן מהיצוק של אגרוז, המאפשר הכתמת אימונו-לוד (IF) והדמיה קונפוקולית של תאים. כמו כן, תאים יכולים להיות מבודדים לצמיחה נוספת או נתון לניתוחים כגון עבור ביטוי גנים או פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS). לבסוף, ניתן לנתח את התרבות ההפוכה תלת-מיוד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר הטבעה וקוריה. שינויים אפשריים של ההסדה כוללים קומפוזיציות שונות של מטריצה חוץ תאית (ECM) כמו גם הכללה של תאים סטרומה או חיסוניים שונים עם התאים הסרטניים.
Introduction
למרות שיפורים משמעותיים אימונותרפיה סרטן בעשור האחרון, ההבנה המכנית שלנו של רגישות והתנגדות לטיפולים הם עדיין עניים למדי1. זה מבוסס היטב כי גידולים להציג הטרוגניות משמעותית, כי האינטראקציות הדינמיות של התאים הסרטניים עם microenvironment שלהם, כמו גם עם התאים החיסוניים, השפעה על מוות תאי הגידול, התנהגות פולשנית ותגובה לטיפולים הכוללים אימונותרפיה1,,2,,3. כזרוע אחת של המערכת החיסונית הסתגלנית, תאי T מבצעים ציטוקסיות ספציפית לתא. הניתוח של זיהוי T-תא ותגובה לתאים סרטניים מספק תובנות מכניות להתנגדות ורגישות לטיפולים אפנון חיסוני.
במבחנה מידול וניטור אינטראקציות בין סרטן ותאי T בסביבה המתאימה היה מאתגר ועד כה, הביא תובנות מכניות מוגבלות. רוב ההתאסות המבוססות על תאים מסתמכות על סביבה דו-ממדית (דו-ממדית), כי חסר תכונות מפתח כי הם קריטיים עבור סיכום תלת מימדי (3D) בפיזיולוגיה vivo4,5,6,כל כךאינטראקציות תא מרחבי, מגע עם מטריצה חוץ תאית (ECM)7, ביקושחילוף חומרים דינמי, היפוקסיהמוגברת בשל צמיחה המונית 8, והשפעות של microenvironment הגידול (TME)9. מצד שני, יש עדיין מספר חסרונות עם כיום בשימוש תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות ומערכות אסה פלישה: (1) את הזמן גוזל אופי של דורספרואידים וקציר 5,10, (2) חוסר שליטה על גודל spheroid,צפיפות צורה ותא 11,12, (3) סוג תפוקה נמוכה תפוקה אומר, (4) הדרישה עבורציוד מיוחד 13,14, (5) הצורך להעביר את התרבות ההתוכית לסביבותנפרדות עבור 15, 16,16,17. בפרט, העברת תרבות שיתוף סד לעתים קרובות מוביל לשיבוש של spheroids ואובדן שלמות התרבות ההתופת. זה חל במיוחד על ספרואידים “רופפים” עם הדבקה מופחתת תא. לדוגמה, רוב המקרים של פלישה תלת-מית’ר דורשים שספרואידים נקצרים לאחר היווצרותם הראשונית ולאחר מכן יתפרסו מחדש ב- ECM14,15,16. שלב זה של התחדשות פעולה כתוצאה מאובדן שליטה על המרחק בין spheroids. מאז המרחק בין spheroids הגידול משפיע על ההתנהגות הפולשנית שלהם, אובדן זה של שליטה מציג סטייה בין-אסראי גבוהה ומפחית את הרבייה. יתר על כן, היישום של שברים תאים אומר על ידי צעדי צנטריפוגציה עוקבים להערכת היקפית וגודול spheroid חדירה תאים חיסוניים מוגבלת לאוכלוסיות תאים סרטניים המייצרים spheroidsיציב יותר 17.
קונספט וגישה
הגישה שלנו מטפלת בליקויים הנ”ל באמצעות מודל “All-in-One” – מודל תרבות שיתופית של ספרואיד תלת-מימד, שאינו דורש העברת ספרואידים עבור האמורות הבאות. התאמנו מכשיר היווצרות spheroid (ראה טבלת חומרים)כדי ליצור תס”א לניטור בו זמנית התנהגות פולשנית של תאים סרטניים וcytotoxicity של תאי T תרבויות. שיטה זו ידידותית למשתמש, זולה ומאפשרת טיפול מהיר וקל בהגדרה תלת-מית-מית-מית-תפוקה גבוהה יחסית. בהתאם לסוג ההתקן המשמש, ניתן ליצור עד 81 כדורי spheroid גדולים בגודל אחיד בשלב pipetting יחיד עם שליטה על גודל spheroid בודד על ידי שינוי מספר התאים שנזרעו. היווצרות ספרואיד נכפתה על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בפיגומים ללא agarose יצוק מרובה היטב עם תחתיות בצורת U. התאמנו את מערכת תלת-מיD זו עבור מחקרים פונקציונליים דינמיים מבוססי תאים, כמו גם נקודות קצה מולקולרי וביוכימי ים הכוללים פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS), immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC) הכתמה, כמו גם ניתוח ביטוי גנים של התרבות השותפות 3D שלם.
עבור מחקריםפונקציונליים , הטבעת spheroids בסוג אני קולגן בתוך agarose מטיל תוצאות פלישה של תאים סרטניים מspheroids equidistant ומאפשר ניטור תכונות חיוניות קו תאים ספציפיים, כגון תא יחיד לעומת הגירה תא קולקטיבי18,,19. יתר על כן, מטריצת קולגן מופרדת בקלות מן יצוק agarose, וכתוצאה מכך תיקון עבה 1\u20122 מ”מ המכיל spheroids מרובים, אשר ניתן לעבד עוד יותר עבור IF-כתמים והדמיה על ידי מיקרוסקופית confocal. זה יכול לחשוף פלישה תאים ברורים ואינטראקציות מטריצת תא בהקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן, תאים במטריצת הקולגן ניתן לבודד לאחר עיכול קולגן ותנתק תא יחיד עבור טיפוח תאים הבאים או ניתוח.
לניתוח IHC של spheroids, לאחר קיבעון וקטוס של יצוק agarose, חלבונים או מולקולות אחרות של עניין ניתנים לזיהוי תוך שמירה על העמדות הגיאוגרפיות של spheroids. בגישה המתוארת כאן, spheroids מוטבעים ישירות Hydroxyethyl agarose עיבוד ג’ל בתוך יצוק agarose ואת הג’ל משמש “מכסה” כדי לשמור על spheroids בתחתית microwells. לאחר הטמימת הפרפין של יציקת agarose20, קטע אופקי סדרתי מבוצע עם החלק התחתון של הגבס משמש כנקודת ההתחלה.
גישה זו מנוגדת לניתוח IHC קונבנציונלי של spheroids הדורש קצירת תאים לפני הטבעה בג’ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose21 וסיכונים הפרעה של spheroids ובכך לאבד את הסידור המרחבי של תאים. כמו כן, שברת תאים על ידי צנטריפוגציה להערכה אם תאים חיסוניים חדרו או נשארו היקפיים לספרואידיםגידול 17 נמנע על ידי הטבעה ישירה.
יתר על כן, 3D שיתוף תרבות יכול להתבצע על ידי גידול admixing, סטרומה או תאים חיסוניים, ובכך ללמוד crosstalk תא סרטני או סיכום microenvironments גידול שונים לניתוח אינטראקציות תא-תאים כולל תרבויות מצטלבות עם תאים אנדותל16.
הגדרה זו 3D spheroid שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לבצע שיתוף תרבות של סוגי תאים שונים הנוכחי microenvironment הגידול כדי להעריך את ההשפעות של אלמנטים ECM שונה. מלבד סוג אני קולגן, רכיבים אחרים ECM (למשל, מטריג’ל, תערובת מטריג’ל / קולגן, פיברונקטין), ניתן להשתמש מאז פלישת תאים סרטניים מושפעת השפע של מצעיםשונים 22. כמו כן, microwells של יצוק agarose מתאימים להיווצרות spheroid של קווי תא ראשיים עבור תאים עם הדבקה תא נמוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן מתארת דור ספרואידי גידול 3D, המאפשר שיתוף תרבות עם תאי T, תאים מבוססי פונקציונליות ומולקולריים, כמו גם מגוון רחב של אפשרויות ניטור וניתוח באמצעות מכשיר יחיד. היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא אינה מחייבת העברת תרבות תלת-מימד לתסה נפרדת ושומרת על שלמות תרבות ה-3D לאורך כל ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לוירג’יני אורי, PhD על דיונים מועילים וייעוץ על הגישה של מודל 3D שיתוף תרבות. אנו מודים גם לאליזבת ג’ונס על סיוע טכני מצוין עם המחלקה IHC. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מDFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft) כדי YL (LI 2547/4-1) ואת המכונים הלאומיים לבריאות AW (R01 CA23 1291), ל-ATR (R01 CA205632), ל-GWP (R01 CA218670) ולמענק הליבה של המרכז לסרטן (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
References
- Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
- Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
- Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
- Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
- Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
- Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
- Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
- Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
- Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
- Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
- Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen’s RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, (2019).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
