Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D
Summary
L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.
Abstract
Des progrès significatifs ont été réalisés dans le traitement du cancer par immunothérapie, bien qu’un grand nombre de cancers restent résistants au traitement. Un nombre limité d’essais permettent une surveillance directe et des connaissances mécanistes sur les interactions entre les cellules tumorales et immunitaires, parmi lesquelles les lymphocytes T jouent un rôle important dans l’exécution de la réponse cytotoxique du système immunitaire adaptatif aux cellules cancéreuses. La plupart des tests sont basés sur la co-culture bidimensionnelle (2D) des cellules en raison de la facilité relative d’utilisation, mais avec une représentation limitée du phénotype de croissance invasive, l’une des caractéristiques des cellules cancéreuses. Les systèmes actuels de coculture tridimensionnelle (3D) nécessitent soit un équipement spécial, soit une surveillance distincte de l’invasion des cellules cancéreuses coculturées et des lymphocytes T en interaction.
Ici, nous décrivons une approche pour surveiller simultanément le comportement invasif en 3D des sphéroïdes de cellules cancéreuses et de cytotoxicité de cellule T dans la co-culture. La formation de sphéroïdes est entraînée par des interactions cellulaires améliorées dans les moulages de microwell agarose sans échafaudage avec des fonds en forme de U. La co-culture des lymphocytes T et l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans les micro-puits des moulages d’agarose sans avoir besoin de transférer les cellules, maintenant ainsi un système de co-culture 3D intact tout au long de l’essai. La matrice de collagène peut être séparée de la fonte d’agarose, permettant la coloration d’immunofluorescence (IF) et pour l’imagerie confocale des cellules. En outre, les cellules peuvent être isolées pour une croissance ultérieure ou soumises à des analyses telles que l’expression des gènes ou le tri des cellules activées par fluorescence (FACS). Enfin, la co-culture 3D peut être analysée par immunohistorichemistry (IHC) après l’intégration et la sectionnement. Les modifications possibles de l’essai incluent des compositions modifiées de la matrice extracellulaire (ECM) ainsi que l’inclusion de différentes cellules stromales ou immunitaires avec les cellules cancéreuses.
Introduction
Malgré des améliorations significatives dans l’immunothérapie contre le cancer au cours de la dernière décennie, notre compréhension mécaniste de la sensibilité et la résistance aux traitements sont encore assez pauvres1. Il est bien établi que les tumeurs affichent une hétérogénéité substantielle, et que les interactions dynamiques des cellules tumorales avec leur microenvironnement ainsi qu’avec les cellules immunitaires, la mort des cellules tumorales d’impact, le comportement invasif et la réponse aux traitements qui incluent l’immunothérapie1,2,3. Comme un bras du système immunitaire adaptatif, les lymphocytes T exécutent la cytotoxicité cellulaire spécifique. L’analyse de la reconnaissance des lymphocytes T et la réponse aux cellules cancéreuses fournit des informations mécanistes sur la résistance et la sensibilité aux traitements modulateurs immunitaires.
La modélisation in vitro et la surveillance des interactions entre le cancer et les lymphocytes T dans un environnement approprié ont été difficiles et, jusqu’à présent, ont donné lieu à des idées mécanistes limitées. La plupart des essais cellulaires reposent sur un environnement bidimensionnel (2D), qui manque de caractéristiques clés essentielles pour la récapitulation de la physiologie in vivo in vivo en trois dimensions (3D) in vivo4,5,6, à savoir les interactions cellulaires spatiales spatiales, le contact avec la matrice extracellulaire (ECM)7, la demande métabolique dynamique, l’hypoxie accrue due à la croissance de masse8, et les effets de la micro-environnement tumorale (TME)9. D’autre part, il y a encore un certain nombre de lacunes avec les systèmes de co-culture et d’essai tridimensionnels (3D) actuellement utilisés : (1) la nature chronophoïde de la génération et de la récolte5,10, (2) le manque de contrôle sur la taille sphéroïde, la forme et la densité cellulaire11,12, (3) les essais de type à faible débit, (4) l’exigence d’équipement spécial13,14, (5) la nécessité de transférer la co-culture dans des environnements distincts pour différents essais15,16,17. En particulier, le transfert d’un test de coculture entraîne souvent une perturbation des sphéroïdes et la perte de l’intégrité de la coculture. Cela s’applique en particulier pour les sphéroïdes « lâches » avec adhérence réduite de cellules-cellules. Par exemple, la plupart des essais d’invasion 3D exigent que les sphéroïdes soient récoltés après leur formation initiale, puis réesspensés dans ECM14,15,16. Cette étape de resuspension entraîne une perte de contrôle sur la distance entre les sphéroïdes. Puisque la distance entre les sphéroïdes de tumeur affecte leur comportement invasif, cette perte de contrôle introduit la variance élevée d’entre-essais et réduit la reproductibilité. En outre, l’application des essais de fractionnement cellulaire par des étapes consécutives de centrifuge pour l’évaluation des cellules immunitaires sphéroïdes périphériques et tumorales est limitée aux populations de cellules tumorales qui génèrent des sphéroïdes plus stables17.
Concept et approche
Notre approche traite des lacunes mentionnées ci-dessus à l’aide d’un modèle de coculture sphéroïde 3D « Tout-en-un », qui ne nécessite pas le transfert de sphéroïdes pour les essais ultérieurs. Nous avons adapté un dispositif de formation sphéroïde (voir tableau des matériaux)pour générer un test pour surveiller simultanément le comportement invasif des cellules cancéreuses et la cytotoxicité des lymphocytes T co-cultivés. Cette méthode est conviviale, peu coûteuse et permet une manipulation rapide et facile dans un réglage 3D à débit relativement élevé. Selon le type d’appareil utilisé, jusqu’à 81 grands sphéroïdes de taille uniforme peuvent être générés en une seule étape de pipetage avec le contrôle de la taille sphéroïde individuelle en modifiant le nombre de cellules ensemencées. La formation de sphéroïdes est forcée par des interactions cellulaires améliorées dans des fontes multi-puits d’agarose sans échafaudage avec des fonds en forme de U. Nous avons adapté ce système 3D pour des études fonctionnelles dynamiques à base de cellules ainsi que des tests moléculaires et biochimiques de point d’évaluation qui incluent le tri des cellules activées par fluorescence (FACS), l’immunofluorescence (IF) ou l’immunohistorichimie (IHC) ainsi que l’analyse d’expression génique de la co-culture 3D intacte.
Pour les études fonctionnelles, l’intégration des sphéroïdes dans le collagène de type I dans les fontes agarose entraîne l’invasion des cellules cancéreuses à partir de sphéroïdes équidistants et permet de surveiller les caractéristiques essentielles spécifiques à la lignée cellulaire, telles que la migration cellulaire unique par rapport à la migration collective des cellules18,19. En outre, la matrice de collagène est facilement séparée de la fonte d’agarose, résultant en un patch de 1\u20122 mm d’épaisseur contenant plusieurs sphéroïdes, qui peut être traitée pour la coloration et l’imagerie IF par microscopie confocale. Cela peut révéler l’invasion cellulaire distincte et les interactions cellule-matrice dans un dépistage à haut débit. En outre, les cellules de la matrice de collagène peuvent être isolées après la digestion de collagène et la dissociation de cellules simples pour la culture ou l’analyse suivante de cellules.
Pour l’analyse ihc des sphéroïdes, après fixation et sectionnage de la fonte d’agarose, les protéines ou d’autres molécules d’intérêt sont détectables tout en maintenant les positions géographiques des sphéroïdes. Dans l’approche décrite ici, les sphéroïdes sont directement incorporés dans le gel de traitement de l’agarose hydroxyéthyl dans la fonte d’agarose et le gel sert de « couvercle » pour retenir les sphéroïdes au fond des micro puits. Après l’incorporation de paraffine de la fonte agarose20, sectionnage horizontal série est effectuée avec le bas de la fonte servant de point de départ.
Cette approche contraste avec la sectionnement classique de l’IHC des sphéroïdes qui nécessite la récolte des cellules avant l’incorporation dans le gel de traitement de l’agarose hydroxyéthyle21 et risque de perturber les sphéroïdes, perdant ainsi l’arrangement spatial des cellules. En outre, la fractionnement cellulaire par centrifugation pour évaluer si les cellules immunitaires infiltrées ou sont restées périphériques aux sphéroïdes de tumeur17 est évitée par l’incorporation directe.
En outre, la co-culture 3D peut être effectuée par la tumeur de mélange, les cellules stromales ou immunitaires, et étudiant ainsi le crosstalk de cellules tumorales ou récapitulant différents microenvironnements de tumeur pour analyser des interactions cellule-cellule comprenant des co-cultures avec des cellules endothéliales16.
Ce réglage de coculture sphéroïde 3D peut être utilisé pour effectuer la co-culture de différents types de cellules présents dans le microenvironnement tumoral et pour évaluer les effets des éléments modifiés d’ECM. Outre le collagène de type I, d’autres composants ECM (p. ex., matrigel, mélanges matrigel/collagène, fibronectine) peuvent être utilisés puisque l’invasion des cellules tumorales est affectée par l’abondance de différents substrats22. En outre, les micro puits de la fonte agarose conviennent à la formation sphéroïde des lignées cellulaires primaires et aux cellules à faible adhérence cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici décrit la génération de sphéroïdes de tumeur 3D, qui permet la co-culture avec des cellules T, des essais fonctionnels et moléculaires à base de cellules, ainsi qu’une variété de possibilités de surveillance et d’analyse utilisant un seul dispositif. Le principal avantage de notre approche est qu’elle ne nécessite pas le transfert de la culture 3D à un test distinct et maintient l’intégrité de la culture 3D tout au long des tests.
Le flux de tr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Virginie Ory, Ph.D. pour ses discussions utiles et ses conseils sur l’approche du modèle de coculture 3D. Nous remercions également Elizabeth Jones pour son excellente assistance technique dans le cadre de l’IHC. Cette étude a été soutenue par des subventions du DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) à YL (LI 2547/4-1) et des National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), à ATR (R01 CA205632), à GWP (R01 CA218670) et à la subvention de base du Centre du cancer (P30 CA51008).
Materials
| 3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
| 8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
| Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
| DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
| Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
| HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
| Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
| Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
| rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
| RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
| Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
| TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |
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