제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.
많은 수의 암이 치료에 저항하는 남아 있지만 면역 요법으로 암 치료에 상당한 진전이 있었습니다. 제한된 수의 아세약은 종양과 면역 세포 사이의 상호 작용에 대한 직접적인 모니터링 및 기계론적 통찰력을 허용하며, 그 중 T 세포는 적응형 면역 계통의 세포 독성 반응을 암세포에 실행하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 아세약은 상대적으로 사용이 용이하기 때문에 세포의 2차원(2D) 공동 배양을 기반으로 하지만 암세포의 특징 중 하나인 침습적인 성장 표현형의 제한된 표현으로 인해. 현재 3차원(3D) 공동 배양 시스템은 공동 배양 된 암세포의 침입과 T 세포 상호 작용에 대한 특수 장비 또는 별도의 모니터링이 필요합니다.
여기서 우리는 공동 배양에서 암 세포 스페로이드 및 T 세포 중독의 3D에서 침습적 행동을 동시에 모니터링하는 접근법을 설명합니다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 마이크로웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 구동됩니다. T세포 공동배양및 암세포 침입을 모두 타입 I 콜라겐 매트릭스로 하여 세포를 전송할 필요 없이 아가로즈 캐스트의 마이크로웰 내에서 수행되므로 분석 전반에 걸쳐 온전한 3D 공동 배양 시스템을 유지한다. 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 분리될 수 있어 면역형광(IF) 염색 및 세포의 공초점 이미징을 허용한다. 또한, 세포는 유전자 발현 또는 형광 활성화 세포 선별(FACS)과 같은 추가 성장을 위해 격리되거나 분석될 수 있다. 마지막으로, 3D 공동배양은 면역히토화학(IHC)을 포함시키고 단면화한 후에 분석될 수 있다. 분석의 가능한 변형은 암세포를 가진 상이한 기질 또는 면역 세포의 포함뿐만 아니라 세포외 매트릭스 (ECM)의 변경 된 조성물을 포함한다.
지난 10 년간 암 면역 요법에 있는 중요한 개선에도 불구하고, 처리에 감도 그리고 저항의 우리의 기계적인 이해는 아직도 상당히 가난한1입니다. 종양이 상당한 이질성을 표시하고, 면역 세포뿐만 아니라 자신의 마이크로 환경과 종양 세포의 동적 상호 작용이 종양 세포 사멸에 영향을 미치고, 침습적 행동및 면역 요법1,,2,3을3포함하는 치료에 대한 반응이 잘 확립된다. 적응형 면역 계통의 한 팔로, T 세포는 세포 특정 세포 독성을 실행합니다. T 세포 인식 및 암세포에 대한 반응의 분석은 면역 변조 치료에 대한 저항과 민감성에 대한 기계적 통찰력을 제공합니다.
적절한 환경에서 암과 T 세포 사이의 체외 모델링 및 모니터링 상호 작용은 도전적이고 지금까지 제한된 기계론적 통찰력을 초래했습니다. 대부분의 세포 기반 아세약은 2차원(2D) 환경에 의존하며, 생체 내생리학 4,5,6,6공간 세포 상호 작용, 세포 외 매트릭스(ECM)와의접촉,세포 외 세포7세포 상호 작용, 세포 외 세포(ECM)와의 접촉, 동적 대사 수요, 대량성장(TME)및 마이크로환경(TME)의 효과로 인한 저산소증(TME) 및 마이크로환경(TME)의 효과에 따라 3차원(3D)을 재구성하는 데 중요한 주요 특징이 부족하다.9 한편, 현재 사용되고 있는 3차원(3D) 공동배양 및 침입 분석 시스템과는 여전히 많은 단점이 있다: (1) 스페로이드 생성및수확5,,10,(2) 스페로이드 크기에 대한 제어부족, 형상 및 세포밀도(11)12,(3) 저처리량 형 어설약, (4)특수장비(13)14,14(5) 상이한 형상을 위한 뚜렷한 환경으로 공동배양을 전송할 필요가 있다15,,16,,17. 특히, 공동 문화 분석의 전송은 종종 스페로이드의 붕괴와 공동 문화 무결성의 손실로 이어진다. 이것은 감소된 세포 세포 접착을 가진 “느슨한” 스페로이드에 특히 적용됩니다. 예를 들어, 대부분의 3D 침입 소법은 스페로이드가 초기 형성 후 수확한 다음 ECM14,,15,,16에서 다시 중단될 것을요구한다. 이 재서스펜션 단계는 스페로이드 사이의 거리를 제어하지 않습니다. 종양 스페로이드 사이의 거리가 침습적 행동에 영향을 미치기 때문에, 이러한 통제 상실은 높은 간 분석 차이를 유발하고 재현성을 감소시킵니다. 더욱이, 세포 분획 의 적용은 면역 세포에 침투하는 말초 및 종양 스페로이드의 평가를 위한 연속원심분리 단계에 의해 보다 안정적인 스페로이드를 생성하는 종양 세포 집단으로제한된다(17).
개념 및 접근 방식
우리의 접근 방식은 후속 에세이를 위해 스페로이드의 전송을 요구하지 않는 “All-in-One”-3D 스페로이드 공동 배양 모델을 사용하여 위에서 언급 한 결함을 해결합니다. 우리는 결합된 T 세포의 암세포의 침습적 행동과 세포 독성을 동시에 모니터링하기 위한 분석서를 생성하기 위해 스페로이드 형성 장치(재료표참조)를 조정했습니다. 이 방법은 사용자 친화적이고 저렴하며 비교적 높은 처리량 3D 설정에서 빠르고 쉽게 처리 할 수 있습니다. 사용되는 장치의 유형에 따라, 최대 81개의 큰 균일한 크기의 스페로이드는 시드된 셀 수를 수정하여 개별 스페로이드 크기를 제어하여 단일 파이펫팅 단계에서 생성될 수 있다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 멀티웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 강요됩니다. 당사는 형광 활성 세포 선별(FACS), 면역형광(IF) 또는 면역히스토케(IHC) 염색뿐만 아니라 그대로 3D 공동 배양의 유전자 발현 분석을 포함하는 종점 분자 및 생화학적 분석을 위한 이 3D 시스템을 조정했습니다.
기능적 연구를위해, 아가로즈 캐스트 내에 제1형 콜라겐에 스페로이드를 삽입하면 등평성 스페로이드로부터 암세포를 침범시키고 단일 세포 대 집단세포이동(18,19)과같은 필수 세포주 별 특징을 모니터링할 수 있다., 더욱이, 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 쉽게 분리되어, 다중 스페로이드를 포함하는 1\u20122 mm 두께 패치가 생성되어, 이는 공초점 현미경검사에 의해 IF 염색 및 이미징을 위해 추가로 처리될 수 있다. 이것은 높은 처리량 검열에 있는 명백한 세포 침략 및 세포 매트릭스 상호 작용을 드러낼 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스내의 세포는 후속 세포 재배 또는 분석을 위해 콜라겐 소화 및 단일 세포 해리 후 분리될 수 있다.
스페로이드의 IHC 분석을위해, 아가로즈 주조의 고정 및 단면 후, 단백질 또는 관심의 다른 분자는 스페로이드의 지리적 위치를 유지하면서 검출할 수 있다. 여기서 설명된 접근법에서, 스페로이드는 아가로즈 주조 내의 하이드록스테틸 아가로즈 가공 젤에 직접 내장되어 있으며, 겔은 마이크로웰의 바닥에 스페로이드를 유지하기 위한 “뚜껑”의 역할을 한다. 아가로즈캐스트(20)의파라핀 포함 후, 직렬 수평 단면은 캐스트의 바닥으로 시작점으로 수행된다.
이 접근법은 Hydroxyethyl 아가로즈 처리젤(21)에 포함되기 전에 세포를 수확해야 하는 기존의 IHC 단면과 대조되며 스페로이드의 붕괴가 세포의 공간 적 배열을 잃을 위험이 있습니다. 또한, 면역 세포가 종양스페로이드(17)에 침투하거나 말초로 남아 있는지 여부를 평가하기 위한 원심분리에 의한 세포 분획은 직접 적인 포함에 의해 피된다.
더욱이, 3D 공동배양은 종양, 기질 또는 면역세포를 혼합하여 수행될 수 있고, 따라서 종양 세포 상호작용을 연구하거나 내피세포와 공동 배양을 포함하는 세포 세포 상호 작용을 분석하기 위한 상이한 종양 마이크로환경을 재수량하여16.
이러한 3D 스페로이드 공동 배양 설정은 종양 미세 환경에 존재하는 상이한 세포 유형의 공동 배양을 수행하고 변경된 ECM 요소의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있다. 제형 I 콜라겐 외에 다른 ECM 성분(예를 들어, 마트리겔, 마트리겔/콜라겐 혼합물, fibronectin) 종양 세포 침전이 상이한기판(22)의풍부에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 사용될 수 있다. 또한, 아가로즈 주조의 마이크로웰은 1차 세포주 및 세포 세포 접착력이 낮은 세포에 적합한다.
여기에 제시된 방법은 T 세포, 세포 기지를 둔 기능 및 분자 분석과 공동 배양을 허용하는 3D 종양 스페로이드 생성뿐만 아니라 단일 장치를 사용하여 다양한 모니터링 및 분석 가능성을 설명합니다. 우리의 접근 방식의 주요 장점은 3D 문화를 별도의 분석으로 이전할 필요가 없으며 분석 전반에 걸쳐 3D 문화의 무결성을 유지한다는 것입니다.
여기에 제시된 워크플로는 필요에 …
The authors have nothing to disclose.
우리는 3D 공동 문화 모델의 접근 방식에 대한 유용한 토론과 조언을 위한 Virginie Ory 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 IHC 단면에 우수한 기술 지원을 엘리자베스 존스 감사합니다. 이 연구는 DFG (도이치 포중지마인샤프트)에서 YL(LI 2547/4-1)과 국립 보건원에서 AW(R01 CA231291), ATR(R01 CA205632), GWP(R01 CA218670), 그리고 GP(R01 CA218670) 및 G5(G101 CA218670)의 보조금에 의해 지원되었다.
3D Petri Dishes | Microtissues Inc | Z764019 & Z764051 | referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds |
8-well Chamber Slides | Lab-Tek | 154534 | |
Agarose Type I, low EEO | Sigma-Aldrich | A6013 | |
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody | Agilent | K4003 | ready to use |
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
Collagenase Type 4, 1 g | Worthington | LS004188 | |
DMEM, fetal bovine serum | ThermoFisher | 11965092, 16000044 | referred to as "cell culture medium" in the protocols |
Harris hematoxylin | ThermoFisher | SH30-500D | |
HistoGel | ThermoFisher | HG-4000-012 | referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols |
Hoechst | Life Technologies | H1399 | 1/1000 dilution |
Phalloidin 546 | Invitrogen | 486624 | 1/200 dilution |
rabbit anti-CD8 antibody | Cell Signaling | 98941 | 1/25 dilution |
rat anti-keratin 8 | DSHB | TROMA-I AB_531826 | 1/500 dilution |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | referred to as "RNA extraction kit" in the protocols |
RPMI | ThermoFisher | 11875093 | for T-cell culture medium |
Triton X-100 | BioRad | 1610407 | referred to as "Octoxynol" in the protocols |
Trizol | ThermoFisher | 15596026 | referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | referred to as "polysorbate 20" in the protocols |
TypLE | ThermoFisher | 12604013 | referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols |