יציבות ומבנה של בת גדולה Histocompatibility קומפלקס מחלקה I עם β הטרולוגי2-מיקרוגלובולין
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטות ניסיוניות להשגת תחליפים מורכבים יציבים של היסטו-תאימות (MHC) מסוג I באמצעות β פוטנציאלייםשל 2-microglobulin (β2מ ‘) החלפות ממינים שונים. ההשוואה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגי הטרולוגי β2מ ‘נחקרו.
Abstract
מתחם ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) ממלא תפקיד מרכזי בהצגת פפטיד אנטיגן ותגובות חיסוניות של תאי T נגד מחלות זיהומיות והתפתחות גידולים. MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגי2-microglobulin (β2מ ‘) החלפה ממינים שונים ניתן לייצב במבחנה. זהו אמצעי ריאלי ללמוד MHC I של יונקים, כאשר הומולוגי β2מ ‘אינו זמין. בינתיים, הוא הצביע על כך β יונקים2מ ‘החלפה אינה משפיעה באופן משמעותי על מצגת פפטיד. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה ואת הטכנולוגיה עבור MHC היברידית אני מורכב עם β הטרולוגית2-microglobulin (β2מ ‘). להלן, מוצגות שיטות להערכת ההיתכנות של החלפה הטרולוגית β2מ ‘במחקר MHC I. שיטות אלה כוללות הכנת מבני ביטוי; טיהור גופי ההכללה וכיסוי מחדש של קומפלקס MHC; קביעת תרמו יציבות חלבון; סינון קריסטל וקביעת מבנה. מחקר זה מספק המלצה להבנת תפקוד ומבנה של MHC I, והוא גם משמעותי להערכת תגובת תאי T במהלך מחלות זיהומיות ואימונותרפיה הגידול.
Introduction
קומפלקס ההיסטו-תאימות העיקרי (MHC) קיים בכל בעלי החוליות והוא קבוצה של גנים הקובעים את החסינות בתיווך התא לפתוגנים זיהומיות. MHC Class I מציג פפטידים אנדוגניים, כגון רכיבים ויראליים המיוצרים על זיהום בנגיף, לקולטנים של תאי T (TCR) על פני השטח של תאי CD8+ T כדי לתווך חסינות תאית ולהשתתף בוויסות החיסון1. מחקר מבני של MHC אני מחייב פפטידים מספק מידע לגבי מוטיבים מחייב פפטיד ותכונות מצגת על ידי מולקולות MHC I, אשר ממלא תפקידים חיוניים בהערכת תגובות חיסוניות CD8+ T תא ופיתוח חיסון.
מאז ההתגבשות הראשונה והקביעה המבנית של MHC I מולקולרית על ידי ביורקמן ואח‘2, ניתוח מבנה הגביש של מולקולות MHC I קידם מאוד את ההבנה כיצד פפטידים נקשרים למולקולות MHC I, ומסייע להבין את האינטראקציה של שרשראות אור עם שרשראות כבדות ופפטידים. סדרה של מחקרי מעקב הצביעו על כך שלמרות שהגנים המקודדים את שרשרת האור אינם קשורים ל- MHC, שרשרת האור היא חלבון מפתח להרכבת מולקולות MHC I3,4. זה אינטראקציה עם שלושת התחומים של מולקולות מסוג MHC I על משטחים מרובים. כאשר שרשרת האור נעדרת, מולקולות מסוג MHC I אינן יכולות להתבטא כראוי על פני השטח של תאים המציגים אנטיגן ואינן יכולות לקיים אינטראקציה עם TCR כדי להפעיל את הפונקציות החיסוניות שלהן.
MHC I מורכב משרשרת כבדה (שרשרת H) ושרשרת קלה (כלומר, β 2-מיקרוגלובולין (β2מ ‘)), ומורכב באמצעות כריכה לפפטידמתאים 5. המקטע החוץ-תאי של שרשרת H מורכב מתחומים α1, α2 ו- α36. התחומים α1 ו α2 יוצרים את חריץ מחייב פפטיד (PBG). שרשרת β2מ ‘משמשת כקומוניט מבני של מתחם ההרכבה ב- MHC I, מייצבת את הקונפורמציה של המתחם, והיא מלווה מולקולרית עבור שרשרת MHC I H המתקפלת7,8,9. סדרה של מחקרים הראו כי MHC I H שרשראות מיונקים שונים כגון עטלף (כירופטרה) (Ptal-N * 01:01)10, מקוק רזוס (פרימטים) (Mamu-B *17)11 (Mamu-A *01)12 (Mamu-A *02)13, עכבר (מכרסם) (H-2Kd)14,15, כלב (קרניבורה) (DLA-88 * 50801)16, בקר (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 וסוסים (פריסodactyla) (Eqca-N * 00602 ו Eqca-N * 00601)18 יכול לשלב עם β הטרולוגי2מ ‘(טבלה 1). מולקולות היברידיות אלה משמשות לעתים קרובות במחקרים מבניים ותפקודיים. עם זאת, המתודולוגיה למחקר הפונקציונלי והמבני של ה- MHC I ההיברידי עם βהטרולוגית 2מ ‘עדיין לא סוכמה. בינתיים, הבסיס המבני למחלף β 2 מ’ביןמסות שונות עדיין לא ברור.
להלן, ההליך עבור ביטוי MHC אני, refolding, התגבשות, איסוף נתוני קריסטל וקביעת מבנה מסוכמים. בנוסף, תחליפים פוטנציאליים של β2מ ‘ממינים שונים מנותחים באמצעות השוואת הקונפורמציה המבנית של MHC אני התייצב על ידי הומולוגית הטרולוגית β2מ ‘. שיטות אלה יהיה מועיל למחקר מבני נוסף MHC אני CD8+ T תאים תגובה חיסונית הערכה בסרטן ומחלות זיהומיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניית קומפלקס חלבונים היברידי באמצעות החלפה הטרולוגית ממסה שונה היא אסטרטגיה נפוצה לחקירות תפקודיות ומבניות כאשר המתחם ההומולוגי אינו זמין, כגון ב- MHC I ובליגנדים שלו. עם זאת, יש סיכום מוגבל לגבי המתודולוגיה והטכנולוגיה. להלן, המבנה של בת MHC אני, Ptal-N * 01:01, התייצב על ידי bβ2m או hβ2מ ‘…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח המדינה של ביוטכנולוגיה פרמצבטית, אוניברסיטת נאן-ג’ינג, סין (גרנט לא. KF-GN-201905), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים 81971501). ויליאם ג’יי ליו נתמך על ידי תוכנית המדען הצעיר המצוינת של NSFC (81822040) ובייג’ינג תוכנית כוכב חדש של מדע וטכנולוגיה (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
- Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
- Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
- Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
- Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
- Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
- Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
- Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
- Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
- Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
- Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
- Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
- Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
- Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
- Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
- Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
- Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
- Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
- Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
- Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
- Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
- Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, 905-921 (1998).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
- Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
- McCoy, W. H. t., Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
- Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).
