Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina
Summary
El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.
Abstract
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.
Introduction
El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la evaluación de las respuestas inmunes a células CD8+ T y el desarrollo de vacunas.
Desde la primera cristalización y determinación estructural del MHC I molecular por Bjorkman et al.2,el análisis de estructura cristalina de moléculas MHC I ha promovido en gran medida la comprensión de cómo los péptidos se unen a las moléculas MHC I, y ayuda a entender la interacción de cadenas ligeras con cadenas pesadas y péptidos. Una serie de estudios de seguimiento indicaron que aunque los genes que codifican la cadena de luz no están asociados con el MHC, la cadena de luz es una proteína clave para el montaje de moléculas MHC I3,4. Interactúa con los tres dominios de las moléculas de clase I de MHC en múltiples superficies. Cuando la cadena de luz está ausente, las moléculas MHC clase I no se pueden expresar correctamente en la superficie de las células que presentan antígenos y no pueden interactuar con TCR para ejercer sus funciones inmunológicas.
MHC I se compone de una cadena pesada (cadena H) y cadena de luz (es decir, β2-microglobulina (β2m)), y se ensambla a través de la unión a un péptido adecuado5. El segmento extracelular de la cadena H consta de α1, α2 y α3 dominios6. Los dominios α1 y α2 forman la ranura de unión de péptidos (PBG). La cadena βde 2m actúa como subunidad estructural del complejo de montaje en MHC I, estabilizando la conformación del complejo, y es una chaperona molecular para la cadena MHC I H plegable7,8,9. Una serie de estudios han demostrado que las cadenas MHC I H de varios mamíferos como murciélago (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, ratón (Rodentia) (H-2Kd)14,15, perro (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, ganado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 y equino (Periss (Eqca-N*00602 y Eqca-N*00601)18 puede combinarse con β heterologous2m (Tabla 1). Estas moléculas híbridas se utilizan a menudo en estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la metodología para el estudio funcional y estructural del MHC I híbrido con β heterologousde 2m aún no se resume. Mientras tanto, la base estructural para el intercambiado β2m entre diferentes taxones sigue sin estar clara.
En este documento, se resume el procedimiento para la expresión MHC I, la refolding, la cristalización, la recopilación de datos de cristal y la determinación de la estructura. Además, se analizan posibles sustituciones de β2m de diferentes especies comparando la conformación estructural del MHC I estabilizada por β2m. Estos métodos serán útiles para un mayor estudio estructural del MHC I y la evaluación de la respuesta inmune de células T CD8+ en cáncer y enfermedades infecciosas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
Materials
| 10 kDa MMCO membrane | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% Acrylamide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5×Protein SDS Loading | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillin | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21(DE3) strain | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| DTT | Solarbio | D1070 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glycerin | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidine hydrochloride | Amresco | E424-5KG | |
| hβ2m | our lab | Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginine Hydrochloride | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| Protein Marker | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing | A112130 | |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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