شاشة القامع لتوصيف الروابط الوراثية التي تنظم العمر الزمني في Saccharomyces cerevisiae
Summary
هنا هو بروتوكول لتحديد التفاعلات الجينية من خلال زيادة عدد الشاشة عدد في Saccharomyces cerevisiae. هذه الطريقة تسمح للباحثين لتحديد واستنساخ واختبار القامع في المسوخ الخميرة قصيرة الأجل. نحن اختبار تأثير زيادة عدد نسخة من SIR2 على عمر في متحولة فارغة autophagy.
Abstract
الشيخوخة هي التدهور الزمني الذي يعتمد على العمليات البيولوجية الطبيعية للكائن الحي الذي يزيد من احتمال الوفاة. العديد من العوامل الوراثية تساهم في التعديلات في عملية الشيخوخة الطبيعية. وتتقاطع هذه العوامل بطرق معقدة، كما يتضح من ثروة الروابط الموثقة التي تم تحديدها وحفظها في العديد من الكائنات الحية. تركز معظم هذه الدراسات على فقدان الوظيفة، والمسوخ الفارغة التي تسمح بالفحص السريع للعديد من الجينات في وقت واحد. هناك عمل أقل بكثير يركز على وصف الدور الذي فرط التعبير عن جين في هذه العملية. في العمل الحالي، ونحن نقدم منهجية واضحة لتحديد واستنساخ الجينات في الخميرة في مهدها، Saccharomyces cerevisiae، للدراسة في قمع نمط نمط العمر الزمني قصير الأجل ينظر في العديد من الخلفيات الوراثية. وقد صُمم هذا البروتوكول ليكون في متناول الباحثين من طائفة واسعة من الخلفيات وفي مختلف المراحل الأكاديمية. تم اختيار الجين SIR2 ، الذي رموز لديسيتيلاز هيستون ، للاستنساخ في ناقلات pRS315 ، كما كانت هناك تقارير متضاربة حول تأثيره على العمر الزمني. SIR2 أيضا يلعب دورا في autophagy، والتي تنتج عندما تعطل عن طريق حذف العديد من الجينات، بما في ذلك عامل النسخ ATG1. كدليل على المبدأ، ونحن استنساخ الجين SIR2 لأداء شاشة القامع على عمر تقصير النمط الظاهري سمة من autophagy ناقص atg1Δ mutant ومقارنتها بخلاف ذلك isogenic، نوع البرية نوع الخلفية الوراثية.
Introduction
الشيخوخة هي فقدان السلامة التي تعتمد على الوقت في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تزيد في نهاية المطاف من احتمال موت الكائنات الحية. الشيخوخة أمر لا مفر منه تقريبا لجميع الأنواع. على المستوى الخلوي هناك العديد من السمات المميزة التي تتميز جيدا التي ترتبط بالشيخوخة، بما في ذلك: عدم الاستقرار الجينومي، والتعديلات اللاجينية، وفقدان بروتيوستاسيس، الخلل الميتوكوندريا، واستشعار المغذيات غير منظم، والشيخوخة الخلوية، والاستنزاف التيلومير1،2. في الكائنات وحيدة الخلية، مثل الخمائر، وهذا يؤدي إلى الحد من إمكانية التكرار والعمر الزمني3،4. تظهر هذه التغيرات الخلوية في الكائنات الحية الأكثر تعقيدًا ، مثل البشر ، كالأمراض التي تشمل السرطانات ، وفشل القلب ، والتنكس العصبي ، والسكري ، وهشاشة العظام5،6،7. على الرغم من التعقيدات العديدة التي تميز عملية الشيخوخة ، هناك الحفاظ على هذه السمات الجزيئية الكامنة في هذه العملية عبر الكائنات الحية المتباينة على نطاق واسع8،9،10. أدى تحديد التعديلات على هذه المسارات أثناء الشيخوخة إلى إدراك أنه يمكن التلاعب بها عن طريق تغيير نمط الحياة – يظهر التقييد الغذائي لإطالة عمر الحياة بشكل كبير في العديد من الكائنات الحية11. هذه المسارات تتلاقى وتتقاطع مع بعضها البعض ومع العديد من المسارات الأخرى، بطرق معقدة. إن توضيح وتوصيف هذه التفاعلات يوفر إمكانية التدخلات العلاجية لإطالة العمر والصحة12،13،14.
حفظ الأسس الجزيئية للشيخوخة يسمح للتشريح الوظيفي للتفاعلات الوراثية الكامنة وراء العملية من خلال استخدام أبسط الكائنات الحية نموذج – بما في ذلك في الخميرة في مهدها, Saccharomyces cerevisiae15,16. هناك نوعان من الشيخوخة الراسخة على غرار الخميرة في مهدها: الشيخوخة الزمنية (العمر الزمني، CLS) والشيخوخة المتماثلة (عمر النسخ المتماثل، RLS)17. يقيس التقادم الزمني مقدار الوقت الذي يمكن أن تبقى الخلية في حالة غير منقسمة. وهذا مشابه للشيخوخة التي ينظر إليها في الخلايا التي تنفق غالبية حياتهم في G0, مثل الخلايا العصبية4. بدلاً من ذلك، عمر تكراري هو عدد المرات التي يمكن أن تقسم خلية قبل الإرهاق وهو نموذج لأنواع الخلايا النشطة mitoticly (على سبيل المثال، عدد الخلايا البناتية التي يمكن أن يكون خلية)18.
الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم بروتوكول يسمح بالتشريح الوظيفي لعلم الوراثة من الشيخوخة باستخدام S. cerevisiae. في حين كانت هناك العديد من الدراسات الممتازة التي قام بها العديد من الباحثين والتي أدت إلى فهمنا الحالي ، لا تزال هناك العديد من الفرص المتاحة للباحثين الناشئين للمساهمة في مجال الشيخوخة من وقت مبكر في حياتهم الأكاديمية. نقدم منهجية واضحة من شأنها أن تسمح للباحثين للمضي قدما في مجال الشيخوخة. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون في متناول جميع الباحثين بغض النظر عن المرحلة في حياتهم الأكاديمية من خلال توفير الأدوات اللازمة لصياغة واختبار فرضياتهم الجديدة. وميزة نهجنا هو أن هذه طريقة فعالة من حيث التكلفة يمكن الوصول إليها بسهولة لجميع الباحثين بغض النظر عن المؤسسة – ولا تتطلب معدات مكلفة ومتخصصة ضرورية لبعض البروتوكولات19. هناك عدة طرق مختلفة لتصميم هذا النوع من الشاشة ، والنهج المبين في هذا العمل هو قابل بشكل خاص لفحص المسوخ فارغة من الجينات غير الأساسية التي تظهر انخفاضا حادا في العمر الزمني مقارنة سلالة ايزوجيني البرية من الخميرة.
كدليل لدينا من حيث المبدأ، ونحن استنساخ SIR2، وهو deacetylase lysine ذكرت كما عرض كل من امتداد وCLS تقصير عندما overexeded. تم العثور مؤخرا على OVEREXPRESSION SIR2 لزيادة CLS في الخمائر صناعة النبيذ; ومع ذلك، فقد أبلغت عدة مجموعات لا توجد صلة بين SIR2 وCLS التمديد، وترك دورها تحت20،21،22. بسبب هذه التقارير المتضاربة في الأدبيات، اخترنا هذا الجين لإضافة بحث مستقل للمساعدة في توضيح دور SIR2 في الشيخوخة الزمنية، إن وجدت. بالإضافة إلى ذلك، زيادة عدد نسخة من homologue SIR2 يمتد عمر في نظام دودة nematode نموذج23.
Autophagy هو نظام تدهور داخل الخلايا لتقديم منتجات cytosolic ، مثل البروتينات والعضيات ، إلى lysosome24. يرتبط Autophagy ارتباطا وثيقا بطول العمر من خلال دوره في البروتينات التالفة المتدهورة والعضيات للحفاظ على التوازن الخلوي25. يعتمد تحريض autophagy على تنسيق التعبير عن العديد من الجينات ، وحذف جين ATG1 النتائج في CLS قصيرة بشكل غير طبيعي في خميرة26في مهدها. رموز ATG1 للبروتين سيرين / ثريونين كيناز المطلوب لتكوين الحوية في autophagy وسيتوبلازم إلى vacuole (ما يعادل lyosomal الفطرية) المسار27,28. هنا، نقدم طريقتنا لزيادة عدد الشاشة نسخة، واختبار تأثير زيادة نسخة SIR2 على CLS في نوع البرية وsهوة – خلفية فارغة atg1. وهذه الطريقة قابلة بصفة خاصة للباحثين المبتدئين ومجموعات البحث في المؤسسات الجامعية في المقام الأول، التي يخدم الكثير منها المجتمعات المحلية الممثلة تمثيلا ناقصا في العلوم وتكون مواردها محدودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن كشف علم الوراثة عن الشيخوخة يشكل تحدياً صعباً، مع العديد من الفرص لمزيد من الدراسة التي يمكن أن تسفر عن رؤى كبيرة في التفاعلات المعقدة الموجودة. هناك العديد من الطرق التي تسمح للجيل السريع من المسوخ فقدان وظيفة لدراسة سلالات فارغة من الخميرة45،46. هذه الطر…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود جيمس ت. أرنوني أن ينوه بدعم الطلاب في دورة تقنيات الحمض النووي المؤتلف في 2017 و2018 في جامعة ويليام باترسون الذين شاركوا في هذا المشروع منذ بدايته، ولكن لم تتجاوز جهودهم عتبة التأليف: كريستوفر أندينو، خوان بوتيرو، جوزفين بوزان، بريندا كالابا، بريندا كوباس، هيدلوف إسل دادزي، إرفين غامارا، ، وين كو، نيلسون ميخيا، هيكتور موتولا، ربيعا ناز، عبد الله عودة، بيرل باغوتان، دانيال رازائي، غابرييلا رئيس الجامعة، عايدة شونو، وماثيو سو. أنتم علماء عظماء وأنا أفتقدكم جميعاً!
الكتاب يود أن نعترف بالدعم الذي لا يقدر بثمن من التعليم وتكنولوجيا البحوث في جامعة وليام باترسون لمساعدتهم : جريج ماتيسون ، بيتر Cannarozzi ، روب ماير ، دانتي بورتيلا ، وهنري هاينيتش. كما يود المؤلفون أن ينوهوا بمكتب النيابة لدعم العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية، ومكتب العميد ومركز البحوث في كلية العلوم والصحة، ودعمهم لهذا العمل، وقسم علم الأحياء لدعم هذا المشروع.
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
References
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
- Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
- Longo, V. D., Fabrizio, P. . Aging Research in Yeast. , 101-121 (2011).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
- Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
- Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
- Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
- Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
- Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
- Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
- He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
- Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
- Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
- Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
- Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
- Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
- Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
- Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
- Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
- Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
- Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
- Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
- Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
- Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
- De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
- Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 122 (1), 19-27 (1989).
- Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).
