Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Summary

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Abstract

Veroudering is de tijdafhankelijke verslechtering van de normale biologische processen van een organisme die de kans op overlijden verhoogt. Veel genetische factoren dragen bij aan veranderingen in het normale verouderingsproces. Deze factoren kruisen elkaar op complexe manieren, zoals blijkt uit de rijkdom van gedocumenteerde links geïdentificeerd en bewaard in vele organismen. De meeste van deze studies richten zich op verlies-van-functie, null mutanten die het mogelijk maken voor een snelle screening van vele genen tegelijk. Er is veel minder werk dat zich richt op het karakteriseren van de rol die overexpressie van een gen in dit proces. In het huidige werk presenteren we een eenvoudige methodologie om genen in de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae,te identificeren en te klonen, voor onderzoek naar onderdrukking van het kortlevende chronologische levenseologisch fenotype dat bij veel genetische achtergronden wordt gezien. Dit protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers met een breed scala aan achtergronden en in verschillende academische stadia. Het SIR2-gen, dat codeert voor een histone deacetylase, werd geselecteerd voor klonen in de pRS315-vector, omdat er tegenstrijdige rapporten zijn geweest over het effect ervan op de chronologische levensduur. SIR2 speelt ook een rol in de autofagie, die resulteert wanneer verstoord door de schrapping van verschillende genen, met inbegrip van de transcriptie factor ATG1. Als bewijs van principe klonen we het SIR2-gen om een suppressorscherm uit te voeren op de verkorte levensduur fenotype die kenmerkend is voor de autofagie-tekort atg1Δ-mutant en vergelijken we het met een anders isogene, wilde genetische achtergrond van het type.

Introduction

Veroudering is het tijdsafhankelijke verlies van integriteit in talloze biologische processen die uiteindelijk de kans op organisale dood verhoogt. Veroudering is bijna onvermijdelijk voor alle soorten. Op cellulair niveau zijn er verschillende goed gekarakteriseerde kenmerken die worden geassocieerd met veroudering, waaronder: genomische instabiliteit, epigenetische veranderingen, verlies-van-proteostase, mitochondriale disfunctie, gedereguleerde voedingsstoffen senseren, cellulaire senscentie, en telomeer uitputting^1,2. In eencellige organismen, zoals gisten, leidt dit tot een vermindering van het replicatief potentieel en de chronologische levensduur^3,4. Deze cellulaire veranderingen manifesteren zich in complexere organismen, zoals mensen, als pathologieën die kankers, hartfalen, neurodegeneratie, diabetes en osteoporose^5,,6,7omvatten. Ondanks de vele complexiteiten die kenmerkend zijn voor het verouderingsproces, is er behoud van deze moleculaire kenmerken die aan dit proces ten grondslag liggen in sterk uiteenlopende organismen^8,9,10. Identificatie van veranderingen in deze trajecten tijdens de vergrijzing leidde tot het besef dat ze kunnen worden gemanipuleerd via veranderingen in levensstijl – dieetbeperking blijkt de levensduur in veel organismen aanzienlijk te verlengen¹¹. Deze paden convergeren en kruisen elkaar en vele andere paden, op complexe manieren. Opheldering en karakterisering van deze interacties biedt mogelijkheden voor therapeutische interventies om de levensduur en de levensduur te verlengen^12,13,14.

Het behoud van de moleculaire onderbouwing van veroudering zorgt voor functionele dissectie van genetische interacties die aan het proces ten grondslag liggen door het gebruik van eenvoudigere modelorganismen – ook in de ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Er zijn twee gevestigde soorten veroudering gemodelleerd door ontluikende gist: chronologische veroudering (de chronologische levensduur, CLS) en replicerende veroudering (de replicante levensduur, RLS)¹⁷. Chronologische veroudering meet de hoeveelheid tijd die een cel kan overleven in een niet-delende toestand. Dit is analoog aan de veroudering die wordt gezien in cellen die het grootste deel van hun leven doorbrengen in G_0,zoals neuronen⁴. Als alternatief is de replicanatieve levensduur het aantal keren dat een cel kan delen vóór uitputting en is een model voor mitotically actieve celtypen (bijvoorbeeld het aantal dochtercellen dat een cel kan hebben)¹⁸.

Het algemene doel van deze methode is om een protocol dat het mogelijk maakt voor de functionele dissectie van de genetica van veroudering met behulp van S. cerevisiaepresenteren . Hoewel er veel uitstekende studies zijn uitgevoerd door veel onderzoekers die hebben geleid tot ons huidige begrip, blijven er veel mogelijkheden voor beginnende onderzoekers om bij te dragen aan de vergrijzing van het veld van het begin van hun academische carrière. We presenteren een duidelijke methodologie die onderzoekers in staat zal stellen om het gebied van veroudering verder te bevorderen. Dit protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor alle onderzoekers, ongeacht de fase in hun academische carrière door het verstrekken van de instrumenten die nodig zijn om te formuleren en testen van hun eigen nieuwe hypothesen. Het voordeel van onze aanpak is dat dit een kosteneffectieve methode gemakkelijk toegankelijk voor alle onderzoekers, ongeacht de instelling – en vereist geen dure, gespecialiseerde apparatuur die nodig is voor sommige protocollen¹⁹. Er zijn verschillende manieren om dit type scherm te ontwerpen, de aanpak die in dit werk wordt beschreven is bijzonder vatbaar voor het screenen van null-mutanten van niet-essentiële genen die een ernstige vermindering van de chronologische levensduur vertonen in vergelijking met een isogene wilde gistsoort.

Als ons bewijs van principe klonen we SIR2, een lysine deacetylase die wordt gerapporteerd als het vertonen van zowel een uitgebreide als een verkorte CLS wanneer overexpressed. SIR2 overexpressie werd onlangs gevonden om CLS in wijnbereidingsgist te verhogen; verschillende groepen hebben echter geen verband gemeld tussen sir2 en CLS-uitbreiding , waardoor zijn rol onder de^{20,21,22 .} Vanwege deze tegenstrijdige rapporten in de literatuur, hebben we dit gen geselecteerd om onafhankelijk onderzoek toe te voegen om de rol van SIR2 in chronologische veroudering te verduidelijken, indien aanwezig. Bovendien verlengt het verhogen van het kopieernummer van een SIR2-homoloog de levensduur in een nematodewormmodelsysteem²³.

Autophagy is een intracellulair afbraaksysteem om cytosolische producten, zoals eiwitten en organellen, te leveren aan de lysosoom²⁴. Autofagie is nauw verbonden met een lange levensduur door zijn rol in het vernederen van beschadigde eiwitten en organellen om cellulaire homeostase²⁵te behouden. Inductie van autofagie hangt af van het orkestreren van de expressie van vele genen, en de verwijdering van het ATG1-gen resulteert in een abnormaal korte CLS in ontluikende gist²⁶. ATG1-codes voor een eiwitservine/threonine kinase die nodig is voor blaasvorming in autofagie en de cytoplasma-to-vacuole (het schimmellysosomale equivalent) pad^27,28. Hier presenteren we onze methode voor een verhoogd kopieernummer scherm, het testen van het effect van verhoogde SIR2 kopie op de CLS in een wild type en een atg1-nullachtergrond. Deze methode is bijzonder vatbaar voor junior onderzoekers en onderzoeksgroepen bij voornamelijk undergraduate instellingen, waarvan vele dienen gemeenschappen ondervertegenwoordigd in de wetenschappen en hebben beperkte middelen.

Protocol

1. Identificeer potentiële genetische interacties voor screening Identificeer de genetische achtergrond(en) voor karakterisering, wat resulteert in een abnormaal kortgebraden chronologische levensduur (CLS) in Saccharomyces cerevisiae met behulp van de Saccharomyces Genome Database (de SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), die bekende fenotypische informatie voor dit organisme samenstelt. Selecteer het tabblad Functi…

Representative Results

Omdat er tegenstrijdige rapporten zijn over de rol van SIR2 tijdens het ouder worden, kozen we dit gen voor studie als mogelijke suppressor van de atg1Δ mutant verkort CLS fenotype26. De rol van SIR2 is enigszins controversieel, met tegenstrijdige rapporten over zijn rol bij de uitbreiding van CLS, maar het is duidelijk gekoppeld aan verhoogde CLS in ten minste één gistachtergrond , met een rol in zowel autofagie als mitophagy22,<sup…

Discussion

Het ontrafelen van de genetica van veroudering is een moeilijke uitdaging, met veel mogelijkheden voor verdere studie die potentieel significante inzichten kunnen opleveren in de complexe interacties die er bestaan. Er zijn vele methoden die het mogelijk maken voor de snelle generatie van verlies-van-functie mutanten voor de studie van null stammen van^{gist 45,46}. Deze methode biedt een eenvoudige aanpak om genen te identificeren en te klonen op de pRS315-vector v…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S