En Suppressor Screen för karakterisering av genetiska länkar reglera kronologisk livslängd i Saccharomyces cerevisiae

Summary

Här är ett protokoll för att identifiera genetiska interaktioner genom en ökad kopia nummer suppressor skärm i Saccharomyces cerevisiae. Denna metod gör det möjligt för forskare att identifiera, klon, och testa suppressors i kortlivade jäst mutanter. Vi testar effekten av kopian antalet ökning av SIR2 på livslängd i en autofagi null mutant.

Abstract

Åldrande är den tidsberoende försämringen av en organisms normala biologiska processer som ökar sannolikheten för dödsfall. Många genetiska faktorer bidrar till förändringar i den normala åldrandeprocessen. Dessa faktorer skär varandra på komplexa sätt, vilket framgår av den mängd dokumenterade länkar som identifierats och bevarats i många organismer. De flesta av dessa studier fokuserar på förlust-of-funktion, null mutanter som möjliggör snabb screening av många gener samtidigt. Det finns mycket mindre arbete som fokuserar på att karakterisera den roll som överuttryck av en gen i denna process. I det nuvarande arbetet presenterar vi en okomplicerad metodik för att identifiera och klona gener i den spirande jästen, Saccharomyces cerevisiae, för studier i undertryckande av den kortlivade kronologiska lifespan fenotyp sett i många genetiska bakgrunder. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för forskare från en mängd olika bakgrunder och i olika akademiska stadier. SIR2-genen, som kodar för en histondeacetylase, valdes ut för kloning i pRS315-vektorn, eftersom det har förekommit motstridiga rapporter om dess effekt på den kronologiska livslängden. SIR2 spelar också en roll i autofagi, som resulterar när störs via radering av flera gener, inklusive transkriptionsfaktorn ATG1. Som ett bevis på princip, vi klona SIR2 genen att utföra en suppressor skärm på den förkortade livslängd fenotyp kännetecknande för autofagi bristfällig atg1Δ mutant och jämföra den med en annars isogen, vild typ genetisk bakgrund.

Introduction

Åldrandet är den tidsberoende förlusten av integritet i otaliga biologiska processer som i slutändan ökar sannolikheten för organismdöd. Åldrande är nästan oundvikligt för alla arter. På cellnivå finns flera väl karakteriserade kännetecken som är förknippade med åldrande, inklusive: genomisk instabilitet, epigenetiska förändringar, förlust-av-proteostasis, mitokondriell dysfunktion, avreglerade näringsämnen avkänning, cellulär senescence, och telomer attrition^1,2. I encelliga organismer, såsom jäst, leder detta till en minskning av replikiv potential och kronologisk livslängd^3,4. Dessa cellulära förändringar manifesteras i mer komplexa organismer, som människor, som patologier som inkluderar cancer, hjärtsvikt, neurodegeneration, diabetes, och benskörhet^5,6,7. Trots de många komplexiteter som kännetecknar processen för åldrande, det finns bevarande av dessa molekylära kännetecken som ligger till grund för denna process över vitt skilda organismer^8,9,10. Identifiering av ändringar av dessa vägar under åldrandet ledde till insikten att de kan manipuleras via livsstilsförändringar – kosten begränsning visas väsentligt förlänga livslängden i många organismer¹¹. Dessa vägar konvergerar och skär med varandra och många andra vägar, på komplexa sätt. Elucidation och karakterisering av dessa interaktioner erbjuder potential för terapeutiska insatser för att förlänga livslängd och healthspan^12,13,14.

Bevarandet av de molekylära underbyggnad av åldrande möjliggör funktionella dissekering av genetiska interaktioner som ligger till grund för processen genom användning av enklare modell organismer – bland annat i spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Det finns två etablerade typer av åldrande modelleras av spirande jäst: kronologiskt åldrande (den kronologiska livslängd, CLS) och replikiv åldrande (den replikiva livslängd, RLS)¹⁷. Kronologiskt åldrande mäter den tid som en cell kan överleva i ett icke-splittrande tillstånd. Detta är analogt med det åldrande som ses i celler som tillbringar majoriteten av sitt liv i G₀, såsom nervceller⁴. Alternativt är replikiv livslängd det antal gånger som en cell kan dela sig före utmattning och är en modell för mitotiskt aktiva celltyper (t.ex. antalet dotterceller som en cell kan ha)¹⁸.

Det övergripande målet med denna metod är att presentera ett protokoll som möjliggör den funktionella dissektion av genetik åldrandet med hjälp av S. cerevisiae. Även om det har varit många utmärkta studier som utförs av många forskare som har lett till vår nuvarande förståelse, det finns fortfarande många möjligheter för spirande forskare att bidra till det åldrande området från början av sin akademiska karriär. Vi presenterar en tydlig metod som gör det möjligt för forskare att ytterligare avancera på åldrandet. Detta protokoll är utformat för att vara tillgängligt för alla forskare oavsett stadium i deras akademiska karriär genom att tillhandahålla de verktyg som krävs för att formulera och testa sina egna nya hypoteser. Fördelen med vårt tillvägagångssätt är att detta är en kostnadseffektiv metod lättillgänglig för alla forskare oavsett institution – och kräver inte dyr, specialiserad utrustning som är nödvändig för vissa^{protokoll 19}. Det finns flera olika sätt att utforma denna typ av skärm, det tillvägagångssätt som beskrivs i detta arbete är särskilt mottagliga för screening null mutanter av icke-väsentliga gener som uppvisar en allvarlig minskning av den kronologiska livslängden jämfört med en isogen vild-typ stam av jäst.

Som vårt bevis på princip, vi klon SIR2, en lysin deacetylase rapporteras som uppvisar både en förlängd och en förkortad CLS när overexpressed. SIR2 överuttryck konstaterades nyligen att öka CLS i vinframställning jäst; emellertid har flera grupper rapporterat någon koppling mellan SIR2 och CLS förlängning, lämnar sin roll under karakteriseras^20,21,22. På grund av dessa motstridiga rapporter i litteraturen, vi valt denna gen för att lägga till oberoende forskning för att hjälpa klargöra rollen av SIR2 i kronologiskt åldrande, om någon. Dessutom ökar kopian antalet av en SIR2 homolog förlänger livslängd i en nematod mask modellsystem²³.

Autofagi är ett intracellulärt nedbrytningssystem för att leverera cytosoliska produkter, såsom proteiner och organeller, till lysosomen²⁴. Autofagi är intimt kopplad till livslängd genom sin roll i förnedrande skadade proteiner och organeller för att upprätthålla cellulär homeostas²⁵. Induktion av autofagi beror på att iscensätta uttrycket av många gener, och strykningen av ATG1 genen resulterar i en onormalt kort CLS i spirande jäst²⁶. ATG1-koder för ett protein serin/treoninkinas som krävs för vesikelbildning i autofagi och cytoplasman-till-vakuol (svampen lysosomekvivalent) utbildningsavsnitt^27,28. Här presenterar vi vår metod för en ökad kopia nummer skärm, testa effekten av ökad SIR2 kopia på CLS i en vild typ och en atg1-null bakgrund. Denna metod är särskilt mottaglig för yngre forskare och forskargrupper vid främst grundutbildningsinstitutioner, av vilka många tjänar samhällen underrepresenterade inom vetenskap och har begränsade resurser.

Protocol

1. Identifiera potentiella genetiska interaktioner för screening Identifiera den genetiska bakgrunden(er) för karakterisering, som resulterar i en onormalt kortsluten kronologisk livslängd (CLS) i Saccharomyces cerevisiae med hjälp av Saccharomyces Genome Database (den SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), som sammanställer känd fenotypisk information för denna organism. Välj fliken Funktion från alt…

Representative Results

Eftersom det finns motstridiga rapporter om rollen som SIR2 under åldrandet, valde vi denna gen för studier som en potentiell suppressor av atg1 mutantenΔs förkorta CLS fenotyp26. Roll SIR2 är något kontroversiellt, med motstridiga rapporter om dess roll i att utvidga CLS, men det har tydligt kopplats till ökad CLS i minst en jäst bakgrund, med en roll i både autofagi och mitofagi22,31,<sup cl…

Discussion

Att reda ut åldrandets genetik är en svår utmaning, med många möjligheter till ytterligare studier som potentiellt kan ge betydande insikter i de komplexa interaktioner som finns. Det finns många metoder som möjliggör en snabb generering av förlust-of-funktion mutanter för studier av null stammar av jäst^45,46. Denna metod presenterar en enkel metod för att identifiera och klona gener på pRS315 vektorn för overexpression suppressor studier. En förde…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S