Summary
Целью этого протокола является синтез флуоресцентно меченных липосом и использование проточной цитометрии для выявления in vivo локализации липосом на клеточном уровне.
Abstract
Растет интерес к использованию липосом для доставки соединений in vivo, особенно для целевых подходов к лечению. В зависимости от состава липосом липосомы могут быть преимущественно поглощены различными типами клеток в организме. Это может повлиять на эффективность терапевтической частицы, поскольку прогрессирование различных заболеваний зависит от тканевого и клеточного типа. В этом протоколе мы представляем один из методов синтеза и флуоресцентной маркировки липосом с использованием DSPC, холестерина и PEG-2000 DSPE и липидного красителя DiD в качестве флуоресцентной метки. Этот протокол также представляет подход к доставке липосом in vivo и оценке клеточно-специфического поглощения липосом с использованием проточной цитометрии. Этот подход может быть использован для определения типов клеток, которые поглощают липосомы, и количественной оценки распределения и доли поглощения липосом между типами клеток и тканями. Хотя это и не упоминается в этом протоколе, дополнительные анализы, такие как иммунофлуоресценция и одноклеточная флуоресцентная визуализация на цитометре, укрепят любые выводы или заключения, поскольку они позволяют оценить внутриклеточное окрашивание. Протоколы также могут быть адаптированы в зависимости от интересующей ткани (тканей).
Introduction
По мере роста интереса к разработке методов лечения с использованием доставки лекарств наночастицами методы подготовки и оценки распределения и поглощения частиц должны продолжать развиваться, расширяться и быть доступными для исследовательского сообщества 1,2. Этот протокол был разработан для оценки точных типов клеток, которые поглощали липосомы in vivo после лечения липосомами, меченными DiD, загруженными тезаглитаром, агонистом рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR)-α/γ 3,4. В этих исследованиях мы смогли оценить, на какие типы клеток непосредственно повлияло лечение липосомальным тезаглитаром, эффективность нацеливания на фрагменты и выдвинуть гипотезы для объяснения результатов лечения, которые мы наблюдали. Кроме того, установленные биологические функции в различных типах клеток позволяют предположить, что фагоцитарные клетки, такие как макрофаги, дендритные клетки и специфические для печени клетки Купфера, поглощают большую часть липосом 5,6,7. Используя этот протокол, мы продемонстрировали, что неклассические фагоциты также могут поглощать липосомы 3,4.
Этот протокол представляет собой оптимизированный метод солюбилизации тезаглитазара, получения липосом путем обратнофазового испарения и использования ацетата кальция в качестве аттрактанта для дистанционной загрузки лекарственного средства. Представленные методы доступны для многих лабораторий и не имеют труднодоступных материалов и этапов, требующих высоких температур. Протокол производит липосомы размеров, оптимальных для увеличения кровообращения invivo 8. Кроме того, как резюмируют Su et al., на сегодняшний день методы оценки распределения липосом in vivo и поглощения тканями были изучены и протестированы в глубине9. Методы позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), магнитно-резонансной томографии (МРТ) и флуоресцентной молекулярной томографии (ТФМ) применяются для количественной оценки тканеспецифического биораспределения и поглощения 9,10,11. Хотя эти методы были оптимизированы для максимального обнаружения in vivo, им все еще не хватает возможности количественно оценить поглощение липосом in vivo при клеточном разрешении. Представленный здесь протокол направлен на удовлетворение этой потребности с помощью проточной цитометрии. Наконец, для этого протокола клеточное поглощение было сужено до нескольких тканей, включая жировую ткань. Появляется все больше литературы, исследующей потенциал использования наночастиц для лечения ожирения, дисметаболизма и воспаления 12,13,14,15,16,17. Таким образом, мы посчитали важным поделиться протоколом с эффективными методами обработки и анализа жировой ткани — одной из тканей, которая играет важную роль в этих патологиях.
Protocol
Все шаги в этом протоколе одобрены и соответствуют рекомендациям Комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Вирджинии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько важных элементов контроля, которые следует учитывать на последующих этапах анализа, которые обобщены в таблице 1 и должны быть рассмотрены до введения липосом.
1. Получение флуоресцентно меченных липосом, нагруженных ацетатом кальция и тезаглитазаром
- Комбинируйте DSPC (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин), холестерин, PEG-2000-DSPE и DiD. Для этого комбинируйте DSPC, холестерин и PEG-2000 DSPE в массовом соотношении 2:1:1. Добавьте липидный краситель DiD в концентрации 1 мг DiD на 1 мл липосом (молярное соотношение 46:1 DSPC:DiD).
ПРИМЕЧАНИЕ: DiD является общепринятой аббревиатурой для 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'тетраметилиндокарбоцианинового красителя. Поскольку он имеет два октадецильных «жировых хвоста» равной длины DSPC, используемого в этом составе, он должен в основном включаться в липидную мембрану. Липидные красители, такие как DiO, DiD и DiI, обычно используются для исследования липосом8 и считаются невзаимозаменяемыми18. - Используйте сцинтилляционный флакон объемом 20 мл для эмульсии инвертированной фазы и препарата липосом. В этом флаконе смешайте эфир-хлороформный раствор липидов 2:1 с водным раствором ацетата кальция (Ca-ацетат, 1 М, рН 7,4). Соотношение между органической и водной фазой должно составлять 4:1, например, 4 мл органической фазы и 1 мл водной фазы.
- Эмульгировать эфир-хлороформный раствор липидов ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. Управляйте ультразвуковым аппаратом на частоте 20 кГц и мощности 50% и используйте 1/2 дюйма. зонд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наконечник зонда ультразвукового аппарата ближе ко дну флакона, чтобы избежать вспенивания. Не прикасайтесь к стеклу наконечником зонда во время обработки ультразвуком, оно может разбиться. Кроме того, хлороформ необходимо добавлять к эфиру в качестве сорастворителя: в присутствии холестерина эмульсия, состоящая только из эфира, быстро отделяется, что делает этот этап процедуры невозможным. - Немедленно поместите флакон с гомогенизированной эмульсией вода в масле на роторный испаритель со специальным адаптером, манометром, манометром и клапаном регулятора давления. Испаритель должен быть подключен к вакуумной линии для удаления органических растворителей. Установите скорость вращения на 100 об/мин и вакуум на 0,5 атм и отпустите, если вспенивание эмульсии выглядит чрезмерным. После того, как гель образуется и исчезает, увеличьте вакуум до 0,9 атм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время удаления летучей органической фазы уровень вакуума следует регулировать постепенно, чтобы избежать быстрого вспенивания, так как это может привести к потере содержимого из флакона в корпус роторного испарителя. В конце концов, когда эфир и хлороформ частично испаряются, а объемное соотношение между водной и органической фазами растворителя близко к 1:1, образуется гель. Испарение должно продолжаться до тех пор, пока гель не исчезнет, а оставшаяся водная среда снова не станет полностью жидкой. Дополнительное смешивание может помочь ускорить удаление органических растворителей. Этого можно достичь, поместив политетрафторэтиленовую мешалку в испарительную колбу для усиления конвекции вязкого геля во время ротационного испарения. - Отфильтруйте полученные липосомы с помощью поликарбонатных мембран с трековым травлением для достижения однородного распределения по размерам.
- Выполняйте фильтрацию, пропуская водную дисперсию липосом туда и обратно несколько раз через поликарбонатный фильтр с порами 200 нм в экструдере липосом, оснащенном двумя газонепроницаемыми шприцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительны шприцы меньшего размера (например, 0,5 мл), поскольку они обеспечивают создание достаточного давления для фильтрации. При высоком содержании холестерина в липосомальной мембране высокая температура не нужна, и процедуру можно проводить при комнатной температуре. Выполняется нечетное количество фильтраций (например, 21), так что полученный материал оказывается на противоположной стороне фильтра с самого начала, и при предварительной стерилизации можно собрать стерильный образец отфильтрованных липосом с поправкой по размеру. Размер получаемых липосом обычно близок к выбранному размеру пор фильтра. Два фильтра могут быть сложены друг на друга (вместо одного) для точной регулировки для уменьшения размера частиц. - Проверка распределения по размерам с помощью динамического лазерного рассеяния света (DLS)3,4.
- Добавьте от 1 до 3 мл физиологического раствора в кювету диаметром 1 см с четырьмя прозрачными сторонами. К этому добавьте 10\u201220 мкл липосом и тщательно перемешайте. Поместите образец в прибор и выберите следующие параметры для измерения: вязкость растворителя, показатель преломления, показатель преломления липидов. Нажмите кнопку «Пуск ». Измерения будут длиться несколько минут и состоять из 100 и более прогонов.
- Выполняйте фильтрацию, пропуская водную дисперсию липосом туда и обратно несколько раз через поликарбонатный фильтр с порами 200 нм в экструдере липосом, оснащенном двумя газонепроницаемыми шприцами.
- Удалите внешний Ca-ацетат с помощью обессоливающей спиновой колонны. К половине партии добавляют водный тезаглитазар в буфер HEPES 10 мМ (рН 7,4) и инкубируют при перемешивании при 37 °C в течение 1 ч. Используйте вторую половину партии в качестве безлекарственного контрольного липосомного состава.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием предварительно уравновесьте спиновую колонку обессоливания объемом 2 мл буфером HEPES 10 мМ с pH 7,4. Для этого поместите 1 мл буфера HEPES в колонку и отжимайте в центрифуге при 1000 x g в течение 2 мин. Удалите сквозной буфер и повторите это четыре раза. - Удалите незахваченный тезаглитазар из липосом с помощью спиновой колонки объемом 2 мл и определите концентрацию захваченного лекарственного средства спектрофотометрически.
- Добавьте не более 0,5 мл образца липосом в слой геля сухой колонки и подождите, пока весь образец не попадет в гель. Центрифугу проводят точно в тех же условиях, что и ранее (1000 х г, 2 мин) и собирают образец липосом в проходной очищенный от мелкомолекулярных соединений соединение.
- Количественная оценка конечных характеристик частиц: размера и концентрации частиц с использованием DLS и дзета-потенциала с помощью комбинированной системы DLS-электрофоректического рассеяния света (ELS)3,4 в буфере HEPES 10 мМ с pH 7,4 и при 25 °C.
- Аналогично этапу 1.5.2, разбавляют дисперсию липосом в измерительном буфере (например, 10 мкл липосом на 1 мл буферного раствора) в U-образную кювету с помощью одноразового шприца Люера или пипетки с отрезанным наконечником. Убедитесь, что в букве «U» нет пузырьков, чтобы было бесперебойное решение для протекания электрического тока.
- Поместите кювету в устройство (обратите внимание на переднюю и заднюю части кюветы, чтобы электроды были правильно подключены к устройству). Закройте дверцу прибора; После этого происходит измерение (с многократными повторами) под контролем программного обеспечения наведения.
2. Подготовьте липосомы для введения in vivo
- В шкафу биобезопасности разбавьте липосомы в стерильном физиологическом растворе до соответствующей концентрации в конечном объеме 50 мкл для введения in vivo.
ПРИМЕЧАНИЕ: В предыдущих исследованиях наш липосомальный препарат содержал 2 мг/мл тезаглитазара, что составляет около 4,89 мкмоль тезаглитазара/мл, и мы вводили липосомы в дозе 1 мкмоль препарата/кг. Для мыши весом 40 г мы бы довели 8,2 мкл липосом до конечного объема 50 мкл физиологического раствора. Используя DLS/ELS, количество липосом на единицу объема также должно быть количественно определено для препаратов липосом, нагруженных лекарственными средствами и транспортными средствами, чтобы гарантировать, что на грамм веса мыши вводится равное количество липосом-носителей по сравнению с липосомами, нагруженными лекарственными средствами. - Загрузите раствор липосом в иглу 27 г в шкафу биобезопасности. Храните его при комнатной температуре, чтобы избежать попадания холодного раствора в мышь.
3. Вводите липосомы с помощью ретроорбитальной внутривенной инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также целесообразно проводить внутривенную инъекцию другими методами, такими как инъекции в хвостовую вену, если это предпочтительно. Хотя это не охвачено этим протоколом, доступны опубликованные протоколы, объясняющие этот метод19 .
- Настройте рабочее пространство для доставки липосом.
- Очистите верстак 70% этанолом. Обязательно выберите место, которое позволяет использовать систему изофлурановой анестезии.
- Включите грелку и положите на нее чистую подушечку или полотенце, чтобы мышь оставалась на чистой поверхности. Дайте достаточно времени, чтобы подушечка прогрелась, прежде чем начинать работу с мышами.
- Настройте анестезиологическую систему так, чтобы камера находилась рядом, а носовой конус находился на согревающей подушке.
- Убедитесь, что все остальные аспекты системы готовы (например, уровень изофлурана в испарителе достаточно высок, угольный фильтр взвешен, трубки подключены правильно).
- Соберите другие материалы, необходимые для этого раздела протокола: офтальмологический гель-смазку, местный анестетик для лечения после введения, стерильные марлевые прокладки.
- Успокойте мышь с помощью изофлурана в индукционной камере. Как только он перестанет реагировать на легкое нажатие ногой, быстро переместите мышь на рабочее место, сохраняя при этом седативный эффект через носовой конус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно поддерживаться на уровне от 1,5% до 2,5% изофлурана и оцениваться на предмет соответствующей глубины анестезии (из-за отсутствия реакции на защемление пальца ноги) перед продолжением процедуры. - Сдвиньте мышь в сторону для введения липосом. Поскольку мышь не будет моргать во время анестезии, нанесите небольшое количество офтальмологической смазки на оба глаза, чтобы они оставались увлажненными в течение оставшейся части процедуры.
- Аккуратно надавите на кожу выше и ниже открытого глаза. Глаз должен приподниматься над плоскостью лица.
- Осторожно вставьте кончик иглы в медиальный кантус, убедившись, что игла находится ниже глаза и не касается его. После того, как игла вставлена под глаз, медленно вводите липосомы в ретроорбитальное пространство. После извлечения иглы может потребоваться закрыть веки на несколько секунд для достижения гемостаза.
- Если игла не введена достаточно далеко, раствор может появиться вокруг глаза. Немедленно прекратите инъекцию, если это видно, и переместите иглу.
- Нанесите местный анестетик, такой как пропаракаин, на глаза, чтобы предотвратить боль и дискомфорт после процедуры.
- Держите мышь на грелке и следите за ней, пока она не проснется, чтобы убедиться, что она здорова и поддерживает надлежащую температуру тела.
- Верните мышь в клетку и в ее обычную среду обитания до тех пор, пока не наступит интересующая точка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в соответствии с местными рекомендациями IACUC.
4. Подготовьте материалы для забора тканей, обработки тканей и окрашивания проточной цитометрией.
- Приготовьте растворы для сбора, обработки и окрашивания (разделы 5\u20127): фосфатно-солевой раствор (PBS)-гепарин, буфер HEPES, 2 мг/мл коллагеназы I типа, буфер для лизиса AKC, буфер FACS, PBS, буфер для фиксации (таблица 2). Во время процедуры храните все растворы, кроме фиксирующего буфера, при температуре 4 °C или на льду.
- Подготовьте пробирки с буферами и другими материалами для заготовки и обработки тканей.
- Для крови каждой мыши добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл для сбора крови. ЭДТА предотвратит свертывание крови. Также необходим шприц объемом 1 мл с иглой 25 г и коническая трубка объемом 15 мл.
- Для селезенки соберите одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл с 1 мл буфера HEPES, шприц объемом 1 мл, две конические пробирки по 50 мл и два фильтра по 70 мкм на селезенку.
- Для каждого депо жировой ткани соберите полиэтиленовый флакон объемом 20 мл с 1,5 мл буфера HEPES для измельчения ткани, коническую трубку объемом 50 мл и фильтр 70 мкм для каждого типа жировой ткани на мышь.
- Подготовьте рабочее пространство для сбора урожая.
- Очистите пространство скамейки 70% этанолом. Подготовьте резиновый лоток для закрепления мыши во время сбора урожая, очистив его 70% этанолом и накрыв впитывающей салфеткой или бумажными полотенцами. Убедитесь, что для работы доступно не менее 5 контактов.
- Наполните шприц объемом 10 мл PBS-гепарином и закрепите на игле 25G для перфузии.
- Соберите инструменты и материалы, чтобы использовать их во время сбора урожая. Необходимы щипцы (две пары), ножницы, бумажные полотенца, безворсовые салфетки, микроцентрифужная пробирка (пробирки) с ЭДТА, микроцентрифужная пробирка (пробирки) с буфером HEPES и полиэтиленовый флакон (флаконы) с буфером HEPES.
5. Соберите ткани
- Усыпить мышь удушьем CO2 . Не проводите вывих шейки матки, так как это может помешать эффективному сбору крови и перфузии тканей на более поздних этапах.
- На убранной скамейке с достаточным рабочим пространством и освещением, чтобы хорошо видеть мышь, установите резиновый лоток для вскрытия, ведро со льдом для хранения образцов и пульверизатор с 70% этанолом. Распылите на мышь 70% этанола, чтобы уменьшить загрязнение и контролировать распространение волос. Положите мышь на спину на резиновый лоток и прижмите ее лапы, расставленные вдали от тела.
- Чтобы подготовиться к сбору крови, аккуратно сделайте надрез на коже по краю каудального конца грудной клетки мыши. Отрежьте небольшую прямую линию вверх по направлению к голове мыши (около 1 см), пока грудные мышцы не обнажаются.
- В месте начального разреза сделайте два небольших надреза перпендикулярно линии по направлению к голове. Затем аккуратно отрежьте грудную мышцу с одной стороны грудной клетки в открытой области. Это обеспечивает лучший доступ и визуализацию того, куда следует вставить иглу.
- Чтобы собрать кровь, вставьте иглу между третьим и четвертым ребрами с той стороны, где была удалена мышца. Поскольку сердце мыши находится в центре грудной полости, держите иглу как можно ближе к центральной линии грудной клетки. После введения осторожно потяните шприц вверх, чтобы начать сбор крови.
- После сбора переложите кровь в подготовленную микроцентрифужную пробирку с ЭДТА и храните на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если объем составляет около 100 мкл и в шприц не попадает кровь, попробуйте повернуть шприц вправо или влево в случае, если отверстие иглы прижато к стенке сердца. Если это не помогает, медленно продвигайте иглу дальше в грудную полость или начинайте извлечение. Если в этот момент в шприце начинает скапливаться кровь, продолжайте медленно оттягивать шприц. Рассмотрите возможность вращения шприца и иглы для успешного извлечения. Наконец, если кровь не собирается, извлеките иглу, так как она могла пропустить сердце. Попробуйте снова вставить иглу и повторить вышеупомянутый процесс еще раз.
- Затем, чтобы перфузировать мышь, откройте грудную полость, чтобы получить доступ к сердцу.
- Для этого срежьте кожу вдоль конца грудной клетки вниз до бока мыши с каждой стороны. Затем используйте щипцы, чтобы удерживать грудину подальше от рабочей поверхности. Сделайте небольшой неглубокий разрез чуть ниже конца грудины, чтобы прорезать брюшную полость. Разрежьте вдоль перитонеальной оболочки по концу грудной клетки с каждой из сторон мыши. Это должно обнажить печень и желчный пузырь. Будьте осторожны, чтобы не порезать ни одну из этих тканей.
- Далее делают небольшой, неглубокий надрез в диафрагме, краниально к печени. Затем разрежьте диафрагму по краю грудной клетки, чтобы открыть грудную полость. Обязательно избегайте разрезания каких-либо органов в грудной полости.
- Сделайте два надреза вдоль грудной клетки по направлению к голове примерно в 2-3 мм от центральной линии мыши и длиной около 0,75 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если разрезать слишком высоко, артерии, расположенные в верхней части грудной клетки, будут перерезаны. Это будет мешать эффективности перфузии. - Поднимите центральную часть грудной клетки, чтобы обнажить грудную полость. Отодвиньте жир или ткани, чтобы получить доступ к сердцу.
- Сделайте небольшой разрез в правом предсердии сердца мыши, чтобы создать отверстие, через которое можно вытолкнуть кровь.
- С помощью шприца PBS-гепарина объемом 10 мл введите иглу в левый желудочек сердца мыши.
- Осторожно начните проталкивать PBS в сердце как можно медленнее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует наблюдать кровь, выходящую из правого предсердия и заполняющую грудную полость. Обязательно держите сердце в его физиологическом положении, чтобы избежать ингибирования потока PBS-гепарина из сердца через аорту. - После того, как все 10 мл PBS-гепарина были перфузированы через мышь, выбросьте шприц и иглу и удалите излишки крови и PBS-гепарина из грудной полости с помощью бумажных полотенец или безворсовых салфеток.
- Затем, чтобы начать извлечение тканей, срежьте кожу и перитонеальную оболочку по направлению к хвосту мыши, чтобы открыть брюшную полость.
- Сначала извлеките подушечку паховой жировой ткани с каждой стороны мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно прочтите этот процесс: обязательно извлеките паховый лимфатический узел из каждого депо, чтобы избежать искажения клеточного состава жировой ткани в результатах.- Используя второй набор щипцов, удерживайте перитонеальную мембрану одним набором щипцов, а край кожи, наложенный над мембраной с этой стороны, другими щипцами. Осторожно оттяните кожу от перитонеальной мембраны, чтобы отделить эти слои друг от друга. Ищите депо паховой жировой ткани вдоль кожи. Прижмите внешний край кожи, чтобы получить лучший доступ к жировому депо.
- Перед извлечением найдите паховый лимфатический узел в центре жирового депо и удалите его с помощью щипцов и ножниц по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, найдите три большие артерии, которые идут от внешних краев депо к центру. Лимфатический узел расположен вокруг того места, где встречаются эти артерии. - После удаления лимфатического узла осторожно удерживайте щипцами ближайший к закрепленной точке конец жирового депо и начинайте делать небольшие надрезы на соединительной оболочке между жировой тканью и кожей. Поднимите жировую ткань от кожи, делая надрезы, чтобы обеспечить лучший доступ к мембране и обеспечить извлечение всего депо.
- Поместите жировое депо в подготовленный полиэтиленовый флакон с буфером HEPES на льду, чтобы сохранить жизнеспособность ткани в течение оставшейся части сбора урожая.
- Повторите этот процесс с другой стороны мыши, чтобы извлечь оба склада. Склады могут быть переварены и обработаны как вместе, так и по отдельности. Если каждый склад должен обрабатываться отдельно, необходимо подготовить больше труб.
- Далее извлекают жировые депо придатка яичка из каудального конца брюшной полости. Используя щипцы, осторожно вытяните первое жировое депо придатка яичка от дорсального конца мыши и найдите придаток яичка и семявыносящий проток, прикрепленные к этому депо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два жировых депо придатка яичка: по одному, прикрепленному к каждому придатку яичка и семявыносящему протоку.- Аккуратно разрежьте жировое депо и придаток яичка и семявыносящего протока, чтобы отделить жировую ткань от этих других тканей. Поместите жировое депо в полиэтиленовый флакон с буфером HEPES на льду, чтобы сохранить жизнеспособность ткани в течение оставшейся части сбора урожая.
- Наконец, извлеките селезенку, которая находится слева от желудка возле диафрагмы. С помощью щипцов аккуратно потяните желудок к центру брюшной полости, чтобы обнажить селезенку.
- Аккуратно возьмитесь за один конец селезенки и слегка оттяните его от живота. Разрежьте оболочку между селезенкой и прилегающей к ней тканью до тех пор, пока орган не отсоединится. Поместите селезенку в подготовленную микроцентрифужную пробирку с буфером HEPES и храните на льду.
- Перед обработкой тканей или сбором тканей от следующей мыши выбросьте тушу и все загрязненные бумажные полотенца или подушечки. Также протрите инструменты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мышей несколько, повторите эти шаги сбора для каждой мыши, прежде чем переходить к следующему этапу обработки. Если включена контрольная мышь / мыши, рассмотрите возможность сбора их перед мышами, обработанными липосомами, чтобы избежать загрязнения.
6. Обработайте ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку жировая ткань имеет длительную инкубацию пищеварения, рекомендуется сначала начать с этого процесса и работать над обработкой крови и селезенки в период пищеварения.
- Сначала пропустите через мясорубку и переварите жировые ткани. Используя одну или две пары ножниц, измельчите жировую ткань в каждом полиэтиленовом флаконе до тех пор, пока ткань не превратится в мелкие кусочки размером менее 0,5 мм. Это позволяет более эффективно переваривать.
- После того, как ткани во всех флаконах измельчены, добавьте 1,5 мл буфера коллагеназы 2 мг / мл в каждый флакон. Поместите флаконы в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C и 150 об/мин. Инкубировать от 30 до 45 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если жировые ткани особенно большие, рассмотрите возможность добавления еще от 0,5 мл до 1,5 мл буфера HEPES и равного объема буфера коллагеназы во флакон (ы), чтобы убедиться, что ткани полностью погружены и присутствует достаточное количество фермента. Конечная концентрация коллагеназы I типа при пищеварении должна составлять 1 мг / мл независимо от конечного объема раствора. Кроме того, если встряхивающий инкубатор недоступен, образцы можно поместить в водяную баню, нагретую до 37 °C. Осторожно встряхивайте образцы каждые 5 минут, чтобы перемешать и возобновить пищеварение. - Проверьте образцы через 30 мин. Используйте пипетку объемом 1 мл, чтобы запипетить образец вверх и вниз. Если кусочки ткани все еще слишком велики для легкого пипетирования, верните образцы в инкубатор еще на 15 минут.
- После того, как образцы полностью переварятся, продолжайте пипетировать образец вверх и вниз еще 10 раз, чтобы убедиться, что была создана одноклеточная суспензия.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Необязательно) Проверьте образцы через 30 минут. Используйте пипетку объемом 1 мл для пипетки образца вверх и вниз. Если кусочки ткани все еще слишком велики для легкого пипетирования, верните образцы в инкубатор еще на 15 минут. - Пипетируйте клеточную суспензию через фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 5 мл буфера FACS в пустой флакон для разложения, чтобы вымыть флакон. Перенесите этот буфер для промывки через фильтр, чтобы добавить его к суспензии клетки.
- Храните образцы на льду, пока другие обрабатываются. После того, как все образцы отфильтрованы, отжарьте их при 400 x g, 4 ° C в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость адипоцита с помощью аспирации, а затем осторожно удалите инфранатант между надосадочной жидкостью адипоцита и гранулой путем аспирации, чтобы оставить гранулу стромально-васкулярной фракции (SVF).
- Ресуспендируют эту гранулу в 1 мл буфера FACS и переносят в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл. Аликвотные ячейки теперь при желании или необходимости. Держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если переваренные жировые депо были большими, рассмотрите возможность использования только 50% или 25% образца для проточного цитометрического окрашивания и анализа. Кроме того, если требуется какой-либо контроль флуоресценции минус один (FMO) или дополнительный контроль для анализа проточной цитометрии (таблица 1), обязательно аликвотируйте дополнительный образец в отдельную пробирку для обработки. FMO используются для различения отрицательного и положительного сигнала для отдельного флуорофроконъюгированного антитела в пределах полной панели, используемой в эксперименте.
- После того, как ткани во всех флаконах измельчены, добавьте 1,5 мл буфера коллагеназы 2 мг / мл в каждый флакон. Поместите флаконы в встряхивающий инкубатор с температурой 37 °C и 150 об/мин. Инкубировать от 30 до 45 минут.
- Во-вторых, обработайте кровь.
- Переведите 50 мкл крови в коническую пробирку объемом 15 мл.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса AKC в каждую пробирку и пипетите вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию. Добавьте дополнительно 4 мл лизирующего буфера AKC в каждую пробирку и инкубируйте в течение 5-10 минут. Если имеется шейкер или ротатор, плотно закройте крышки трубок и поместите трубки на одну из них, чтобы улучшить перемешивание.
- Добавьте 5 мл буфера FACS, чтобы погасить процесс лизиса, и отжимайте образцы при 400 x g, 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и проверьте гранулы. Если он все еще довольно красный, повторите процесс лизиса. В противном случае ресуспендируют гранулы в 1 мл буфера FACS и переносят в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл. Держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией.
- Наконец, обработайте селезенку. Перенесите селезенку на фильтр 70 мкм через коническую трубку объемом 50 мл. Промойте ткань 1 мл буфера FACS, а затем разомните селезенку через фильтр с помощью плунжерного конца шприца объемом 1 мл. На протяжении всего процесса затирания промойте клетки в коническую пробирку объемом 50 мл, используя больше буфера FACS. Конечный объем в конической пробирке должен составлять 10 мл.
- Вращайте клетки при 300 x g при 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 1 мл буфера для лизиса AKC. Добавьте еще 4 мл буфера для лизиса AKC и инкубируйте в течение 5 минут. Добавьте 5 мл буфера FACS, чтобы погасить процесс лизиса, и отжимайте образцы при 300 x g при 4 ° C в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл буфера FACS. Перенесите суспензию через второй чистый фильтр 70 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Добавьте 4 мл буфера FACS, чтобы промыть исходную пробирку, и пропустите буфер через фильтр для получения конечного объема 5 мл.
- Перенесите 50 мкл клеточной суспензии в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 или 1,7 мл и держите на льду до тех пор, пока все образцы не будут готовы к окрашиванию проточной цитометрией. Дополнительные аликвоты могут быть перенесены в пробирки, если требуется больше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спленоциты являются отличными клетками для использования для одиночного окрашивания Live/Dead. Рассмотрите возможность переноса дополнительной аликвоты для этого элемента управления.
7. Окрашивание клеток из тканей для проточной цитометрии
- Отжим аликвотированных образцов при 400 x g, 4 °C в течение 5 мин.
- Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 50 мкл Fc-блока (разбавленного) (таблица 2). Инкубировать на льду 5 мин.
- Добавьте 50 мкл смеси 2x антител (таблица 3) к каждому образцу. Инкубировать на льду в темноте в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любые отдельные пятна НЕ должны окрашиваться этой смесью антител. Кроме того, если будут использоваться FMO, смеси антител FMO должны быть приготовлены отдельно. - Промойте образцы 1 мл PBS и отжимайте при 400 x g, 4 ° C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 200 мкл жизнеспособного пятна (таблица 3). Инкубировать на льду в темноте в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не забудьте окрасить ячейки, которые были отложены для одиночного пятна «Живой/мертвый». - Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 400 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы (кроме живого/мертвого одиночного окрашивания) в 50 мкл фиксирующей среды (реагент А) для фиксации образцов. Инкубировать при комнатной температуре в темноте 15 мин.
- Ресуспендировать одинарное окрашивание Live/Dead в 100 мкл 2% PFA. Выдержать при комнатной температуре в темноте 5 мин.
- Промойте образец 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в буфере FACS объемом от 250 до 500 мкл. Хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока образцы не будут наведены на проточный цитометр.
- Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 50 мкл среды для пермеабилизации (реагент B) плюс антитела к внутриклеточным белкам. Выдержать при комнатной температуре в темноте 20 мин.
- Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g при 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 100 мкл 2% параформальдегида (ПФА). Выдержать при комнатной температуре в темноте 5 мин.
- Промойте образцы 1 мл буфера FACS и отжимайте при 800 x g, 4 °C в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте образцы в 250–500 мкл буфера FACS. Хранить при температуре 4 °C до тех пор, пока образцы не будут наведены на проточный цитометр.
Representative Results
Производство липосом
Результаты, опубликованные здесь, аналогичны результатам в нашей ранее опубликованной работе 3,4,20. Используя представленный здесь протокол, мы рассчитываем получить липосомы размером примерно 150\u2012160 нм. DLS показывает средний диаметр липосом 163,2 нм и дзета-потенциал -19,2 мВ (рис. 1A). Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) выявляет кольцевые липосомы (рис. 1B), а диаграмма DLS показывает относительно небольшое стандартное отклонение от среднего диаметра (рис. 1C).
Положительное связывание липосом требует контроля, обработанного PBS
В предыдущих исследованиях нашей группы, использующих этот протокол, изучалось, какие клеточные субпопуляции в жировой SVF, селезенке и крови связаны с липосомами после одной недели введения in vivo 3,4. Используя мышь, обработанную PBS, клетки перитонеальной полости и селезенки окрашивали той же панелью антител, что и на образцах мышей, обработанных липосомами. Ткани собирали после одной недели обработки (рис. 2А). Образцы, взятые у мышей, обработанных PBS, служили DiD FMO, с помощью которого создавались положительные затворы DiD (рис. 2B, C). Положительный затвор может быть создан с использованием DiD-положительного сигнала, но образцы, в которых отсутствует DiD-сигнал, также должны использоваться для проверки того, что положительный затвор не содержит DiD-отрицательных образцов.
Титрование необходимо для оптимизации сигналов флуоресценции
Перед проведением полноценного эксперимента необходимо оптимизировать различные условия, включая концентрацию флуоресцентно конъюгированных антител, используемых при окрашивании клеток, и липидного красителя, используемого при подготовке липосом. Проточные цитометры имеют верхний предел обнаружения интенсивности флуоресценции, поэтому слишком много красителя, включенного в липосомы, приведет к неизмеримым уровням сигнала DiD в образцах, проходящих через цитометр. Кроме того, слишком большое количество DiD в липосомах может привести к высоким уровням неспецифического переноса красителя, что может исказить результаты клеточного поглощения. На рисунке 3 представлены результаты эксперимента, в котором концентрации липидного красителя титровали для определения концентрации, которая давала бы оптимальный сигнал в пределах диапазона обнаружения используемого проточного цитометра. Это было проведено на тканях, представляющих интерес для заключительного эксперимента: крови (рис. 3A), паховой жировой SVF (рис. 3B) и жировой SVF придатка яичка (рис. 3C). Концентрации, выбранные для тестирования, составляли 10 мг DiD (высокий, красный), 1 мг DiD (средний, синий) или 0,1 мг DiD (низкий, серый) на 1 мл липосом. Самая высокая концентрация, используемая в липосомах, была слишком высокой и превышала количественный диапазон цитометра во всех трех тканях (рис. 3A\u2012C, красный). Самая низкая концентрация DiD показала некоторый сигнал (рис. 3 A\u2012C, серый), но четкой популяции за пределами клеток, обработанных PBS (рис. 3A\u2012C, черный), не наблюдалось. При количественной оценке среднее арифметическое DiD MFI для каждой ткани и концентрации продемонстрировало четкое различие между контролем PBS и средней концентрацией DiD (рис. 3D). Таким образом, как указано в протоколе, мы выбрали среднюю концентрацию (рис. 3, синий) для использования в нашем препарате липосом.
Использование панели с несколькими антителами позволяет идентифицировать поглощение липосом различными подгруппами клеток
С помощью панели, описанной в таблице 3, клетки окрашивали антителами против маркеров макрофагов, В-клеток, Т-клеток, дендритных клеток, моноцитов и эндотелиальных клеток (рис. 4). Для каждого типа тканей требуются немного разные стратегии стробирования, но большинство одних и тех же типов клеток могут быть идентифицированы в каждом из них. Некоторые исключения включают эндотелиальные клетки, которые обычно не обнаруживаются в крови, и моноциты, которые, как правило, имеют более высокую частоту в крови, чем другие ткани. После того, как популяции идентифицированы, общий размер каждой клеточной популяции и частота, с которой они являются DiD +, могут быть количественно определены. Дальнейшие расчеты могут быть выполнены для характеристики популяции DiD+: какой процент клеток DiD+ составляют макрофаги, эндотелиальные клетки и т. д. Обратите внимание, что это примеры стратегий стробирования, но не единственный способ анализа образцов. Анализ будет продиктован выбранной панелью и доступными проточными цитометрами.
Рисунок 1: Пример характеристик подготовленных липосом.
(A) Размер и дзета-потенциал были измерены, как описано выше, и были представлены в виде таблицы. Каждый параметр представлен в виде среднего значения ± стандартного отклонения. (B) Крио-ЭМ использовали для визуализации подготовленных липосом. Белая шкала имеет длину 50 нм. (C) DLS был использован для создания гистограммы диаметра липосом в этом препарате. Этот рисунок адаптирован из Osinski et al.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативное окрашивание DiD у мышей, обработанных PBS или липосомами.
(A) Экспериментальная схема для лечения PBS и липосом. PBS или липосомы вводили три раза в течение одной недели. Ткани собирали на 8-й день лечения. (В, В) Репрезентативные графики потока показывают положительное окрашивание DiD у мышей, обработанных липосомами (C), но не у мышей, обработанных PBS (B). FSC, прямой скаттер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Титрование DiD в липосомах.
Липосомы были приготовлены с тремя различными концентрациями DiD и введены мышам. Серый цвет указывает на низкую концентрацию при 0,1 мг DiD на 1 мл липосом, синий указывает на среднюю концентрацию при 1 мг DiD / мл липосом, а красный указывает на высокую концентрацию при 10 мг DiD / мл липосом. Мышь, обработанная PBS, использовалась в качестве отрицательного контроля (черная). Кровь (А, круг), паховая жировая ткань (В, треугольник) и придаток яичка (С, квадрат) собирали через 24 часа после инъекции и обрабатывали для выделения одноклеточной суспензии. Эти образцы были запущены на проточном цитометре до уровня обнаруживаемого DiD. Тканеспецифические гистограммы с наложениями каждой группы лечения представлены для демонстрации интенсивности флуоресценции на концентрацию (A\u2012C). Среднее арифметическое DiD также было количественно определено для каждой ткани и концентрации и построено на графике (D). SSC = боковой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный анализ проточной цитометрии клеточных субмножеств в жировой SVF, крови и селезенке.
(А\u2012С) Схематичный представитель стратегии стробирования для идентификации клеточных подмножеств и клеток DiD+ в жировой SVF (A), селезенке (B) и крови (C). Сокращения: FSC = прямой скаттер; LD = живой/мертвый; L-DCs = лимфоидные дендритные клетки; M-DCs = миелоидные дендритные клетки; SSC = боковой разброс. Этот рисунок адаптирован из Osinski et al.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Контроль | Цель |
| Мышь, обработанная PBS или физиологическим раствором | Используйте клетки этой мыши для следующих контрольных операций проточной цитометрии: |
| 1. Неокрашенные клетки | |
| 2. Живое/мертвое одиночное пятно | |
| 3. Клетки, окрашенные полной панелью, но лишенные флуоресценции липосом для определения положительного сигнала липосом во время анализа | |
| Эта / эти мышь / мыши также будут использоваться для определения того, оказывают ли липосомы какие-либо эффекты in vivo, поскольку в вашем эксперименте будет нелипосомный контроль. | |
| Ненагруженные липосомы | Если вы загружаете соединение в свои липосомы, часть вашей партии липосом должна быть синтезирована без соединения. Это объясняет любые эффекты in vivo только липосом. |
| ДиД в одиночку | Поскольку DiD также может поглощаться клеточными мембранами, выделение некоторых мышей для получения свободного красителя в количестве, равном количеству, обнаруженному в липосомах, поможет объяснить любое фоновое окрашивание мембраны. |
| Управление флуоресценцией минус один (FMO) | Это клетки, окрашенные всеми, кроме одного из антител в вашей панели. Как и #3 в поле выше, это помогает определить истинный положительный сигнал для этого антитела во время анализа |
Таблица 1: Элементы управления, используемые в этом протоколе.
| Решение | Компоненты | Приблизительный объем, необходимый для каждой партии/мыши |
| Подготовка липосом | ||
| Ацетат кальция | 1 М ацетат кальция в H2O | 50 мл |
| Буфер HEPES | 10 мМ HEPES при H2O, pH 7,4 | 50 мл |
| Tesaglitazar в HEPES | в 10 мМ HEPES | 10 мл |
| Заготовка, обработка и окрашивание тканей | ||
| Фосфатно-буферный раствор (ПБС) | 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO4 в дистиллированном H2O | 2 мл |
| ПБС-Гепарин | 0,1 мМ гепарина в PBS | 10 мл |
| Буфер HEPES | 20 мМ HEPES в PBS | 5 мл |
| Буфер для пищеварения | 2 мг/мл коллагеназы I типа в буфере HEPES | 5 мл |
| Буфер лизиса AKC | 0,158 М NH 3 Cl,10 мМ KHCO3, 0,1 мМ Na 2 ЭДТА в ddH 2 O, pH7,2 | 15 мл |
| Буфер СУИМ | 1% BSA, 0,05%NaN3 в PBS | 15 мл |
| Fc Block (разбавленный) | 1:50 Fc Block в буфере FACS | 250 мкл |
| Буфер фиксации | 2% параформальдегида в PBS | 200 мкл |
Таблица 2: Растворы для приготовления.
| A | B | C | D |
| Внеклеточное окрашивание (2-кратная смесь антител) | |||
| Антиген | Флуорофор | Объем Ab на 100 мкл теста | Общий необходимый объем: |
| КД45 | ПерКП | 0,5 мкл | Столбец C x 1,2 x Всего # выборок |
| CD11b | PerCP Cy5.5 | 0,25 мкл | (0,5 мкл на тест) x (1,2) x (# образцы) |
| Ф4/80 | ПЭ Cy7 | 0,25 мкл | (0,25 мкл на тест) x (1,2) x (# образцы) |
| КД19 | ПЭ-КФ594 | 1 мкл | (0,25 мкл на тест) x (1,2) x (# образцы) |
| СД3 | ФИТК | 1 мкл | (1,0 мкл/тест) x (1,2) x (# образцы) |
| КД31 | БВ605 | 0,25 мкл | и так далее... |
| CD11c | БТР ef780 | 1 мкл | |
| КД115 | ЧП | 1,5 мкл | |
| Чтобы создать смесь антител, объедините антитела, рассчитанные в столбце D, с буфером FACS или буфером для окрашивания бриллиантового фиолетового цвета* до конечного объема (50 мкл x 1,2 x общее # образцы) | |||
| Живое/мертвое окрашивание (1x) | |||
| Живой/Мертвый | Флуорофор | Объем L/D на тест 200 мкл | Общий необходимый объем: |
| Живой/Мертвый | Аква | 0,67 мкл | Столбец C x 1,2 x Всего # выборок |
| Внутриклеточное окрашивание (1x) | |||
| Антиген | Флуорофор | Объем Ab на тест 50 мкл | Общий необходимый объем: |
| αSMA | ФИТК | 0.125 | Столбец C x 1,2 x Всего # выборок |
| * Буфер для окрашивания Brilliant Violet следует использовать, если в вашей панели используется более одного антитела, конъюгированного с флуорофором Brilliant Violet. | |||
Таблица 3: Пример панели антител и расчеты окрашивающих смесей, используемых для окрашивания потоком.
Discussion
Здесь мы описываем состоящий из трех частей протокол для (i) приготовления липосом, помеченных флуоресцентным липидным красителем и загруженных антидиабетическим соединением, тезаглитазаром, (ii) введения липосом мыши посредством ретроорбитальной инъекции и (iii) сбора, обработки и окрашивания тканей для обнаружения поглощения липосом на клеточном уровне с помощью проточной цитометрии. В этом протоколе рассматривается подготовка липосом размером около 150 мкм и оценка поглощения жировой тканью, кровью и селезенкой. Липосомный препарат является масштабируемым, выполняется в основном при комнатной температуре и использует обратнофазное испарение для максимизации загрузки лекарственного средства и удаления органических растворителей. Используя этот протокол, можно достичь концентрации тезаглитазара до 2 мг/мл в очищенном образце липосомы. Подготовленные липосомы можно хранить в буфере HEPES при температуре 4 °C более года. По нашему опыту, они продемонстрировали минимальную вариацию среднего размера частиц. Спектрофотометрически было продемонстрировано снижение содержания лекарственного средства менее чем на 10% после ультрафильтрационного отделения липосом от внешнего лекарственного средства с помощью центробежного фильтра 10 кДа.
Во время подготовки липосом необходимо учитывать некоторые важные шаги и факторы. Во-первых, порядок шагов протокола важен и должен соблюдаться. Во-вторых, рН раствора, используемого при загрузке тезаглитазара, должен поддерживаться на уровне 7,4, чтобы максимизировать растворимость и эффективную загрузку. В-третьих, правильная сборка оборудования и фильтров гарантирует, что производительность каждого этапа будет соответствующего размера и чистоты. Например, если фильтры 100 и 200 нм не собраны должным образом, может получиться более разнородная партия липосом неправильного размера. В-четвертых, полное удаление Ca-ацетата перед загрузкой препарата необходимо для максимального переноса тезаглитазара в липосомы. Чтобы проверить полное удаление Ca-ацетата, используйте высокоскоростное осаждение для удаления липосом, а затем измерьте уровни Ca-ацетата в нелипосомальном растворе. В-пятых, важно взвешивать и регистрировать массу всех материалов, добавляемых в препарат липосом на каждом этапе. Это гарантирует, что можно рассчитать правильные концентрации и поддерживать необходимые соотношения материалов. Наконец, если техника не выполняется должным образом, может возникнуть нежелательный уровень гетерогенности. Важно тщательно проверить этот параметр с помощью DLS и других подходов, таких как электронная микроскопия. Чтобы улучшить однородность, рассмотрите возможность регулировки выбранного размера фильтра или наложения двух фильтров.
Кроме того, крайне важно, чтобы контроль и панель антител для проточной цитометрии были спланированы и оптимизированы до проведения этого протокола в полном объеме (таблица 1, таблица 3). Антитела должны быть протестированы, чтобы убедиться, что для окрашивания используются надлежащие концентрации и что перекрытие между флуорофорами минимально. Возбуждение и выделение красителя, используемого во время подготовки липосом, также должны учитываться при планировании панели. В наших результатах мы использовали DiD, который имеет аналогичное возбуждение и излучение флуорофорам, таким как аллофикоцианин (APC) и AlexaFluor 647. Таким образом, мы не выбирали антитела, конъюгированные с этими флуорофорами, в нашей панели антител. Кроме того, в этот протокол не включены элементы управления изотипами. Это связано с тем, что антитела, выбранные для этого протокола, являются хорошо проверенными, коммерчески доступными антителами. Однако, если вы заинтересованы в использовании антитела, которое не было оптимизировано ранее, рассмотрите возможность тестирования антитела против контроля изотипа на интересующих тканях перед проведением полного эксперимента.
Хотя этот протокол демонстрирует, как извлекать и обрабатывать кровь, селезенку, паховую жировую ткань и жировую ткань придатка яичка из мышей после лечения, этот общий подход может быть применен к другим тканям. В зависимости от интересующей ткани может потребоваться изменение протоколов обработки и пищеварения, как это опубликовано для следующих тканей: легкое 21, печень22, брюшная полость 3, костный мозг3,23, мозг 24.
Важным ограничением этого метода, которое следует учитывать, является то, что поглощение может быть оценено только в один момент времени для каждого животного. Таким образом, может быть выгодно соединить этот протокол с другими неинвазивными методами визуализации или соответствующим образом спланировать, чтобы обеспечить достаточные ресурсы для проведения оценки. Время клеточного поглощения и клеточного оборота являются важными факторами, которые следует учитывать: липосомы будут циркулировать по всему телу в течение первых 24 часов, и в зависимости от продолжительности жизни клеток, которые поглощают липосомы, или от того, как они реагируют на поглощение, может произойти гибель клеток или дальнейший фагоцитоз. Наше предыдущее исследование продемонстрировало изменения популяционных характеристик популяций DiD+ в разные моменты времени3. По этой причине важно оценивать поглощение в более ранние моменты времени или моменты времени, наиболее релевантные биологии интересующего механизма. Кроме того, в то время как количественная оценка поглощения клеток во всей ткани может быть выполнена с помощью этого протокола, проточная цитометрия не может выявить локализацию ткани. Сочетание этого подхода с гистологическими методами может помочь устранить это ограничение.
В целом, этот протокол дополняет существующую методологию, такую как гистология и флуоресцентная визуализация всего тела. С дальнейшим развитием инструментов и методов проточной цитометрии станет возможной разработка более крупных панелей для все более и более специфических клеточных популяций. Мы предлагаем использовать этот протокол в дополнение к вышеупомянутым методам, поскольку это улучшит оценку клеточного поглощения, а также даст возможность проверить результаты, наблюдаемые с помощью проточной цитометрии. Например, следует ли обнаружить, что большинство частиц в жировой ткани были поглощены макрофагами с помощью проточной цитометрии. Иммунофлуоресценция дополнительной аликвоты той же жировой ткани может быть сохранена, зафиксирована, разрезана и окрашена на макрофагальные маркеры, чтобы убедиться, что тип клеток действительно поглощает липосомы. Этот подход должен добавить строгости к проводимым анализам биораспределения наночастиц: проверка клеточного нацеливания, количественная оценка клеточного поглощения, выявление нецелевого поглощения и, надеюсь, предоставление информации для генерации механистических гипотез о наблюдаемых терапевтических результатах. Этот протокол также может быть адаптирован для будущих исследований с использованием различных липосом, изучения поглощения в других тканях и тестирования новых соединений в условиях ожирения и дисметаболизма или любого другого заболевания, при котором доставка наночастиц является возможным терапевтическим вариантом.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Майклу Солге и остальным сотрудникам Центра проточной цитометрии за обучение и услуги по проточной цитометрии. Авторы также выражают благодарность Шиве Саи Кришне Дасу, Дастину К. Баунайту, Мелиссе А. Маршалл, Джеймсу С. Гарми, Шантель МакСкимминг, Адити Упадхье и Прасаду Шрикакулапу за их помощь в подготовке липосом (SSKD, DKB), сборе тканей (MAM, JCG), окрашивании проточной цитометрией и сборе образцов (AU, PS, CM). Эта работа была поддержана грантами AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 и R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 и T32 HL007284.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL syringe | BD | 309659 | |
| 10-mL syringe | BD | 302995 | |
| 25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
| 27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
| Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
| Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
| Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
| Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
| Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
| Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
| Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
| Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
| Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
| Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
| Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
| FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
| Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
| Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
| Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
| Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
| Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
| Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
| Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
| Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
| Sonicator | Misonix | XL2020 | |
| T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
| Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
| Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
| ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).
- Osinski, V., et al. In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects. Theranostics. 10 (2), (2020).
- Bauknight, D. K., et al. Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects. PLoS ONE. 14 (11), (2019).
- Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity. BioMed Research International. , (2017).
- He, H., Ghosh, S., Yang, H. Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases. Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).
- Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases. Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).
- Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes. BBA - Biomembranes. , (1994).
- Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging. PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).
- Larmann, J., et al. In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation. Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).
- Feng, B., et al. Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice. PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).
- Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance. The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).
- Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice. Biomaterials. 110, 81-88 (2016).
- Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues. Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).
- Nakhlband, A., et al. Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective. BioImpacts. , (2018).
- Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment. International Journal of Nanomedicine. , (2018).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. Journal of Cell Biology. , (1986).
- Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).
- Dasa, S. S. K., et al. Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer. Theranostics. , (2018).
- Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis. Journal of Clinical Investigation. , (2003).
- Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation research. , (2019).
- O'Brien, C. A., Harris, T. H. ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain. PLoS ONE. , (2020).
