Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.

Summary

Descrevemos aqui um protocolo para caracterizar interações proteína-proteína entre duas proteínas altamente diferentes expressas em Pseudomonas aeruginosa viva usando medidas FLIM-FRET. O protocolo inclui construções de cepas de bactérias, imobilização de bactérias, rotinas de análise de dados de imagem e pós-imagem.

Abstract

As interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células. A microscopia de imagem por imagem de fluorescência (FLIM) combinada com a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) fornece informações precisas sobre PPIs em células vivas. A FLIM-FRET baseia-se na medição da decadência ao longo da vida de um doador de FRET em cada pixel da imagem FLIM, fornecendo informações quantitativas e precisas sobre PPIs e suas organizações celulares espaciais. Propomos aqui um protocolo detalhado para as medições FLIM-FRET que aplicamos para monitorar PPIs em Pseudomonas aeruginosa ao vivo no caso particular de duas proteínas interativas expressas com números de cópias altamente diferentes para demonstrar a qualidade e robustez da técnica em revelar características críticas dos PPIs. Este protocolo descreve detalhadamente todas as etapas necessárias para a caracterização do PPI – desde construções mutantes bacterianas até a análise final usando ferramentas recentemente desenvolvidas fornecendo possibilidades avançadas de visualização para uma interpretação direta de dados complexos FLIM-FRET.

Introduction

Interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células¹. Os papéis dos PPIs diferem com base na composição proteica, as afinidades funcionam e locais nas células². Os PPIs podem ser investigados por meio de diferentes técnicas³. Por exemplo, a co-imunoprecipitação é uma técnica relativamente simples, robusta e barata comumente usada para identificar ou confirmar PPIs. No entanto, estudar PPIs pode ser desafiador quando as proteínas interativas têm baixos níveis de expressão ou quando as interações são transitórias ou relevantes apenas em ambientes específicos. Estudar os PPIs que ocorrem entre as diferentes enzimas da via pyoverdine em P. aeruginosa requer que a repressão do repressor geral de ferro-co-fatorado Fur seja aliviada para permitir que a expressão de todas as proteínas da via de pyoverdine seja expressa na célula^4,5,6. Esta regulação comum para todas as proteínas da via resulta em expressões oportunas na célula esperadas para promover suas interações. A diversidade em termos de tamanho, natureza, níveis de expressão e o número de proteínas dessa via metabólica dificultam o estudo em sistemas reconstituídos⁶. Explorar PPIs em seu ambiente celular é, portanto, fundamental para entender melhor as funções biológicas das proteínas em seu contexto nativo.

Apenas poucos métodos, incluindo a fluorescência, permitem explorar PPIs em células vivas⁷. Entre os diferentes parâmetros de fluorescência que podem ser medidos, a vida útil da fluorescência (ou seja, o tempo médio que um fluoróforo permanece em seu estado animado antes de emitir um fóton) é provavelmente um dos parâmetros mais interessantes para explorar em células vivas. A vida fluorescência de um fluoróforo é altamente sensível ao seu ambiente e a FLIM pode, portanto, fornecer informações químicas ou físicas sobre o entorno do fluorohore⁸. Isso inclui a presença de transferência de energia de ressonância Förster (FRET) que pode ocorrer na presença de um “aceitador” de fluorescência localizado a uma curta distância de um “doador” de fluorescência. A transferência de energia resulta em encurtamento significativo da vida útil da fluorescência do doador(Figura 1A),tornando a Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) uma abordagem poderosa para explorar interações proteína-proteína diretamente em células vivas. A FLIM pode fornecer ainda informações espaciais sobre onde as interações ocorrem nas células^7,8. Essa abordagem é extremamente poderosa para investigar PPIs em situações em que a rotulagem com fluoroforos dos dois parceiros interagindo é possível.

Para que o FRET ocorra – são necessárias condições críticas na distância entre dois fluoroforos^8,9. Os dois fluoroforos não devem estar distantes um do outro por mais de 10 nm. Portanto, devem ser tomadas precauções ao projetar experimentos FLIM-FRET para garantir que o doador e o tomador da fluorescência tenham a chance de estarem próximos um do outro no complexo de interação. Embora isso possa parecer constrangedora, é de fato uma verdadeira vantagem, pois a dependência da distância do FRET garante que duas proteínas rotuladas submetidas ao FRET tenham que interagir fisicamente(Figura 1A). As dificuldades em obter respostas claras sobre o PPI em experimentos de colocalização (duas proteínas colocalized podem não necessariamente interagir) não são, portanto, um problema usando FLIM-FRET.

Figura 1: Princípio de análise FLIM-FRET. Cada pixel da imagem multidimensional FLIM-FRET contém informações sobre a decadência da fluorescência registrada neste local específico (#counts = número de fótons detectados no canal t). (A) A representação clássica da imagem FLIM é geralmente uma imagem 2D codificada por cores falsas (esquerda). Uma diminuição na vida média de fluorescência do doador – como visto por uma mudança na escala de cor – pode ser observada na presença de FRET e é informativa sobre a presença de PPIs nesta área espacial. (B) Sobreposição entre o espectro de emissão de doadores e o espectro de absorção aceitador é necessária para que o FRET ocorra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um segundo requisito para fret é que o espectro de emissão do doador e os espectros de absorção do aceitador devem se sobrepor⁸ (Figura 1B). A excitação da fluorescência do doador deve estar em comprimentos de onda que contribuem muito pouco para a excitação da fluorescência direta do aceitador. Nem todas as combinações de fluoroforos são possíveis e também recomendamos usar preferencialmente doadores com decaimentos monoexponenciais de fluorescência para facilitar as interpretações FLIM-FRET¹⁰. Vários casais de proteínas de fluorescência atendem a esses requisitos, incluindo o popular casal eGFP-mCherry¹¹ (para uma revisão na paleta de pares FRET de proteína fluorescente disponíveis ver^12,13).

FLIM-FRET permite medir a fluorescência de um doador de FRET em cada pixel de uma imagem FLIM(Figura 1A). Existem duas técnicas principais para determinar a vida útil da fluorescência que diferem na aquisição e análise: domínio de frequência (FD)¹⁴ e domínio de tempo (TD). O TD FLIM é mais difundido e é realizado usando uma iluminação pulsada combinada com diferentes configurações possíveis de detecção, incluindo os métodos de gating¹⁵, câmera de raia¹⁶ ou técnicas de contagem de fótons único (TCSPC)⁸. Para as técnicas de FD e TD, a vida útil da fluorescência não é diretamente medida, mas requer uma análise dos dados medidos para estimar a vida útil ou a presença de interações. Para as técnicas de TCSPC, a análise mais utilizada baseia-se na adequação das decaimentos com funções únicas ou multinenciais utilizando re-convoluções iterativas menos quadradas que minimizam a soma ponderada dos resíduos.

Finalmente, flim-FRET pode ser realizado tanto usando excitações de fótons únicos ou multifotos. As últimas têm várias vantagens como reduzir a autofluorescência e fotodamage fora do plano focal. Excitações multifoton permitem também uma maior profundidade de excitação se trabalhar em amostras 3D grossas⁸. Pelo contrário, a excitação de fótons único é geralmente mais eficiente, pois as seções transversais de absorção de dois fótons de proteínas fluorescentes são limitadas^{a 17}.

Aqui, propomos um protocolo para medições FLIM-FRET de PPIs em P. aeruginosa ao vivo no caso particular de duas proteínas interativas (PvdA e PvdL) expressas com números altamente diferentes de cópias para demonstrar a qualidade e robustez da técnica em revelar características críticas dos PPIs. As proteínas PvdA e PvdL estão envolvidas na biossíntese de pyoverdine. PvdA é um L-ornithine N5-oxygenase e sintetiza o L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine de L-ornithine por hidroxication (PvdA) e formylation (PvdF)¹⁸. PvdL é uma enzima de síntese de peptídeos não ribossômicos (NRPS) composta por quatro módulos. O primeiro módulo catalisa a aciilação do ácido mirístico. O segundo módulo catalisa a ativação do L-Glu e sua condensação para o myristic-coA. Em seguida, o terceiro módulo condensa um aminoácido L-Tyr que é então isomerizado em D-Tyr. Finalmente, o quarto módulo une um aminoácido L-Dab (ácido diaminobutírico) para formar o tripeptídeo aciclado L-Glu/D-Tyr/L-Dab⁶. O PvdL é, portanto, responsável pela síntese dos três primeiros aminoácidos do precursor de pyoverdine. A interação da proteína PvdA com PvdL é surpreendente, pois o PvdL, ao contrário do PvdI e pvdJ, não carrega um módulo específico para o L-N5-formyl-N5-hidroxiornithine. Essa interação sugere que todas as enzimas responsáveis pela biossíntese precursora de pyoverdine estão dispostas em grandes complexos multienzimáticos transitórios e dinâmicos^19,20.

Neste relatório explicamos em detalhes como construir as cepas bacterianas expressando nativamente as duas proteínas interajadas e SFP e mCherry. Descrevemos também a preparação da amostra e as condições para imagens eficientes das células FLIM-FRET. Finalmente, propomos um tutorial passo a passo para análise de imagens, incluindo uma ferramenta recentemente desenvolvida que fornece possibilidades avançadas de visualização para interpretação direta de dados complexos FLIM-FRET. Com este relatório, gostaríamos de convencer não apenas os aventureiros, mas a maioria dos biólogos de que o FRET-FLIM é uma técnica acessível e poderosa capaz de responder às suas perguntas sobre os PPIs diretamente no ambiente celular nativo.

Protocol

1. Construção plasmid Amplificar por dois PCR (PCR1 e 3) as sequências de DNA (usar DNA genômico de P. aeruginosa PAO1) dos 700 pares de base rio acima e rio abaixo das regiões correspondentes ao local de inserção em P. aeruginosa genoma com polimerase de DNA de alta fidelidade. Adicione sites de restrição aos primers em azul e verde e adicione uma sequência sobreposta com mCherry aos primers em vermelho(Figura 2). Para PvdA rotulado no C-terminu…

Representative Results

Funções de distribuição cumulativa empírica (ecdf) das vidas de fluorescência medidas para as diferentes cepas bacterianas são mostradas na Figura 8. Se ocorrer o FRET, os ecdfs são deslocados para as vidas de menor duração(Figura 8A,8B). Note-se que quando a interação das duas proteínas resulta em uma longa distância entre os dois fluoroforos, não pode ocorrer nenhum TRAF(Figura 8C). Essa situação …

Discussion

FLIM-FRET oferece algumas vantagens importantes sobre a imagem FRET baseada em intensidade. Fluorescência vitalícia é um parâmetro intrínseco do fluoróforo. Como consequência, não depende das concentrações locais de fluoroforos nem da intensidade da excitação da luz. A vida útil da fluorescência também é também mal afetada pelo branqueamento fotográfico. É particularmente interessante evidenciar PPIs em células onde concentrações de proteínas locais podem ser altamente heterogêneas em todos os com…

Materials

525/50 nm band-pass filter	F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter	F75-680, AHF, Germany
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL	ThermoFisher Scientific	EP0714
E. coli TOP10	Invitrogen	C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode	SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm	Knitel glass	MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL	ThermoFisher Scientific	F530S
Lysogeny broth (LB)	Millipore	1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)	Sigma-Aldrich	10034-99-8
Microscope slides (25×75mm)	Knitel glass	MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
NucleoSpin Plasmid	Macherey-Nagel	740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Succinate (Disodium)	Sigma-Aldrich	14160
SPCImage, SPCM software	Becker & Hickl
Sterile inoculating loop	Nunc	7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL	ThermoFisher Scientific	15224017
TCSPC module	SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser	Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL	Falcon	352070