قياسات FLIM-FRET للتفاعلات البروتينية البروتينية في البكتيريا الحية.
Summary
نحن نصف هنا بروتوكولاً لتوصيف التفاعلات البروتينية بين بروتينين مختلفين للغاية في Pseudomonas aeruginosa باستخدام قياسات FLIM-FRET. ويشمل البروتوكول المنشآت سلالة البكتيريا، وشل البكتيريا، والتصوير، وما بعد التصوير الروتينية تحليل البيانات.
Abstract
تتحكم التفاعلات البروتينية البروتينية (PPIs) في العمليات الرئيسية المختلفة في الخلايا. يوفر التحليل المجهري للتصوير الشعاعي للتصوير الشعاعي (FLIM) المُدمج مع نقل طاقة الرنين بالرنين الفلوري (FRET) معلومات دقيقة حول مؤشرات أسعار المنتجين في الخلايا الحية. FLIM-FRET يعتمد على قياس اضمحلال الفلوريسنس مدى الحياة من المتبرع FRET في كل بكسل من الصورة FLIM، وتوفير معلومات كمية ودقيقة حول PPIs ومنظماتها الخلوية المكانية. نقترح هنا بروتوكول مفصل لقياسات FLIM-FRET التي طبقناها لمراقبة PPIs في Live Pseudomonas aeruginosa في حالة معينة من اثنين من البروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها بأرقام نسخ مختلفة للغاية لإثبات جودة وقوة التقنية في الكشف عن الميزات الحرجة لـ PPIs. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوصيف مؤشر أسعار المنتجين – بدءا من المنشآت البكتيرية المتحولة حتى التحليل النهائي باستخدام أدوات وضعت مؤخرا توفير إمكانيات التصور المتقدمة لتفسير مباشر للبيانات FLIM-FRET المعقدة.
Introduction
البروتين البروتين التفاعلات (PPIs) السيطرة على العمليات الرئيسية المختلفة في الخلايا1. تختلف أدوار PPIs على أساس تكوين البروتين ووظائف التقارب والمواقع في الخلايا2. يمكن التحقيق PPIs عن طريق تقنيات مختلفة3. على سبيل المثال، إن التشارك في المناعة هو تقنية بسيطة نسبياً وقوية وغير مكلفة تستخدم عادة لتحديد أو تأكيد مؤشرات أسعار المنتجين. ومع ذلك، يمكن أن تكون دراسة مؤشرات أسعار المنتجين صعبة عندما يكون البروتينات المتفاعلة ذات مستويات تعبير منخفضة أو عندما تكون التفاعلات عابرة أو ذات صلة فقط في بيئات محددة. دراسة PPIs التي تحدث بين الإنزيمات المختلفة للمسار p. aeruginosa يتطلب أن قمع الحديد العام- شارك في عوامل قمع الفراء هو تخفيف للسماح للتعبير عن جميع البروتينات من المسار pyoverdine للتعبير عنها في الخلية4,5,6. هذا التنظيم المشترك لجميع البروتينات من المسار النتائج في الوقت المناسب التعبيرات في الخلية المتوقع أن تعزز تفاعلاتها. إن التنوع من حيث الحجم والطبيعة ومستويات التعبير وعدد البروتينات لهذا المسار الأيضي يجعل من الصعب الدراسة في النظم المعاد تشكيلها6. ولذلك فإن استكشاف مؤشرات أسعار المنتجين في بيئتها الخلوية أمر بالغ الأهمية لزيادة فهم الوظائف البيولوجية للبروتينات في سياقها الأصلي.
فقط بعض الطرق بما في ذلك fluorescence تسمح استكشاف PPIs في الخلايا الحية7. من بين معلمات الفلوريسنس المختلفة التي يمكن قياسها ، فإن عمر الفلوريسنس (أي متوسط الوقت الذي يبقى فيه الفلوروفور في حالته المتحمسة قبل انبعاث فوتون) هو على الأرجح أحد أكثر المعلمات إثارة للاهتمام لاستكشافها في الخلايا الحية. عمر الفلوروفور الفلوري حساس جداً لبيونته، وبالتالي يمكن لـ FLIM توفير معلومات كيميائية أو فيزيائية فيما يتعلق بمحيط الفلوروفور8. وهذا يشمل وجود Förster نقل الطاقة الرنين (فريت) التي يمكن أن تحدث في وجود “مقبول” من الفلوريس تقع على مسافة قصيرة من “المانحة” fluorescence. نقل الطاقة النتائج في تقصير كبير من فلورية المانحة مدى الحياة (الشكل 1A)، مما يجعل الفلوريسنس التصوير المجهرية مدى الحياة (FLIM) نهجا قويا لاستكشاف البروتين البروتين التفاعلات مباشرة في الخلايا الحية. يمكن لـ FLIM بالإضافة إلى ذلك توفير معلومات مكانية حول مكان حدوث التفاعلات في الخلايا7و8. وهذا النهج قوي للغاية في التحقيق في مؤشرات أسعار المنتجين في الحالات التي يكون فيها وضع العلامات مع الفلوروفوريس من الشريكين المتفاعلين ممكناً.
لFRET أن يحدث – الظروف الحرجة على المسافة بين اثنين من الفلوروفور مطلوب8،9. وينبغي أن لا يكون الفلوروفورين بعيدين عن بعضهما البعض بأكثر من 10 نانومتر. لذلك، يجب أخذ التحذيرات عند تصميم تجارب FLIM-FRET لضمان أن المانح ومقبل الفلوريسنس لديهم فرصة ليكونوا قريبين من بعضهم البعض في المجمع المتفاعل. وفي حين أن هذا قد يبدو مقيداً، فإنه في الواقع ميزة حقيقية لأن الاعتماد على المسافة من فريت يضمن أن اثنين من البروتينات الموسومة التي تخضع لفريت يجب أن تتفاعل جسدياً(الشكل 1A). ولذلك فإن الصعوبات في الحصول على إجابات واضحة عن مؤشر أسعار المنتجين في تجارب الميكالوك (قد لا يتفاعل بالضرورة بروتينان مُقَدَّمان) ليست مشكلة باستخدام FLIM-FRET.
الشكل 1: مبدأ التحليل FLIM-FRET. كل بكسل من FLIM-FRET صورة متعددة الأبعاد يحتوي على معلومات حول تسوس الفلوريس سجلت في هذا الموقع المحدد (#counts = عدد الفوتونات المكتشفة في قناة t). (A) التمثيل الكلاسيكي لصورة FLIM هو عادةً صورة 2D مشفرة بالألوان الخاطئة (يسار). ويمكن ملاحظة انخفاض متوسط عمر المفلورة للمتبرع – كما يتضح من تغير في مقياس اللون – في وجود فريت، وهو مفيد بشأن وجود مؤشرات أسعار المنتجين في هذه المنطقة المكانية. (B) التداخل بين طيف الانبعاثات من المتبرع وطيف امتصاص المتقبل ضروري لحدوث فريت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وثمة شرط ثان لفريت هو أن الطيف انبعاث من المانح وأطياف امتصاص من المتقبل ينبغي أن تتداخل8 (الشكل 1B). وينبغي أن يكون استثارة المفلورة من المانح في أطوال موجية التي تسهم قليلا جدا في الإثارة المفلورة المباشرة للمقبل. ليس كل تركيبات من الفلوروفورات ممكنة، ونحن نوصي بالإضافة إلى ذلك لاستخدام الجهات المانحة بشكل تفضيلي مع تحلل الفلورين أحادية النطاق لتسهيل تفسيرات FLIM-FRET10. العديد من الأزواج من البروتينات fluorescence تلبية هذه المتطلبات، بما في ذلك زوجين eGFP-mCherry شعبية11 (لاستعراض على لوحة من البروتين الفلوري المتاحة FRET أزواج انظر12،13).
FLIM-FRET يسمح قياس تسوس عمر الفلوريسنس من المتبرع FRET في كل بكسل من صورة FLIM(الشكل 1A). هناك تقنيتان رئيسيتان لتحديد عمر الفلور الذي يختلفان في الاكتساب والتحليل: مجال التردد (FD)14 والمجال الزمني (TD). TD FLIM هو أكثر انتشارا ويتم تنفيذها باستخدام الإضاءة النبضية جنبا إلى جنب مع مختلف تكوينات الكشف المحتمل بما في ذلك طرق الغاء15، كاميرا16 خط أو وقت الفوتون واحد المترابطة العد (TCSPC) تقنيات8. وبالنسبة لكل من تقنيات FD و TD، لا يقاس عمر الفلوريسنسي بشكل مباشر ولكنه يتطلب تحليلاً للبيانات المقاسة لتقدير العمر أو مدى وجود التفاعلات. بالنسبة لتقنيات TCSPC، يعتمد التحليل الأكثر استخدامًا على تركيب التحللات مع وظائف مفردة أو متعددة الأسية باستخدام أقل تكراري تربيعي من إعادة الالتواء التي تقلل من مجموع المرجح للمخلفات.
وأخيراً، FLIM-FRET يمكن تنفيذها باستخدام الإثارة الفوتونية أو متعددة الصور على حد سواء. أحدث مزايا عدة مثل الحد من autofluorescence وphotodamage من الطائرة المحورية. الإثارة متعددة الصور تسمح أيضا عمق الإثارة أطول إذا كان يعمل في عينات سميكة 3D8. على العكس من ذلك، الإثارة الفوتون واحد عادة ما يكون أكثر كفاءة كما يتم تحديد المقاطع العرضية امتصاص اثنين فوتون من البروتينات الفلورسنت17.
هنا، نقترح بروتوكولا لقياسات FLIM-FRET من PPIs في حي P. aeruginosa في حالة معينة من اثنين من البروتينات التفاعل (PvdA وPvdL) أعرب عن ذلك مع أعداد مختلفة جدا من النسخ لإثبات جودة ومتانة تقنية في الكشف عن السمات الحرجة من PPIs. وتشارك البروتينات PvdA وPvdL في التركيب الحيوي pyoverdine. PvdA هو L-ornithine N5-oxygenase ويركب L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine من L-ornithine بواسطة الهيدروكسيل (PvdA) و formylation (PvdF)18. PvdL هو إنزيم غير الريبوسومي الببتيد (NRPS) يتكون من أربع وحدات. الوحدة الأولى تحفز الأحماض الميرية. الوحدة الثانية تحفز تفعيل L-Glu والتكثيف إلى الميرستية-coA. ثم, الوحدة الثالثة يكثف الأحماض الأمينية L-تاير التي يتم بعد ذلك isomerized في D-تاير. وأخيرا، فإن الوحدة الرابعة تربط L-Dab (حمض ديامنوبتيريك) من الأحماض الأمينية لتشكيل ثلاثية الptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. وهكذا فإن PvdL هي المسؤولة عن تخليق الأحماض الأمينية الثلاثة الأولى من السلائف pyoverdine. إن تفاعل بروتين PvdA مع PvdL يثير الدهشة حيث أن PvdL ، على العكس من PvdI و PvdJ ، لا يحمل وحدة خاصة بـ L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. هذا التفاعل تشير إلى أن جميع الانزيمات المسؤولة عن السلائف البيوفردين يتم ترتيبها في مجمعات متعددة الأنزيمات العابرة والديناميكية19,20.
في هذا التقرير نشرح بالتفصيل كيفية بناء السلالات البكتيرية التي تعبر عن أصلين تتفاعل eGFP و mCherry وصفت البروتينات. كما أننا نُصف إعداد العينات وظروف التصوير الفعال لخلية FLIM-FRET. وأخيرا ، نقترح خطوة بخطوة تعليمي لتحليل الصور بما في ذلك أداة وضعت مؤخرا توفير إمكانيات التصور المتقدمة للتفسير المباشر للبيانات FLIM -FRET معقدة. مع هذا التقرير، نود أن نقنع ليس فقط المغامرة ولكن معظم علماء الأحياء أن فريت-FLIM هو تقنية سهلة الوصول وقوية قادرة على معالجة أسئلتهم حول PPIs مباشرة في البيئة الخلوية الأصلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET يقدم بعض المزايا الرئيسية على كثافة القائم على التصوير فريت. عمر الفلوريسنس هو معلمة جوهرية من الفلوروفور. ونتيجة لذلك، فإنه لا يعتمد على تركيزات محلية من الفلوروفهور لا على شدة الإثارة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك ، يتأثر عمر الفلوريسنس أيضًا بشكل سيئ بتبييض الصور. ومن المثير للاهتمام…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف الدكتور لودوفيك ريتشرت لمساعدته القيمة على الحصول على البيانات FLIM وللصيانة التقنية وتطوير الإعداد FLIM. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منح من مؤسسة من أجل إعادة التشيرش (https://icfrc.fr/). يتم تمويل VN من قبل مؤسسة من أجل Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906). تعرب جمعية الشبان المسيحية عن امتنانها لـ Institut Universitaire de France (IUF) لدعمه وتوفيره وقتًا إضافيًا للأبحاث. 41- ويعترف معهد الخدمات العامة وشركة جي جي بالمعهد المعني بتسليم المخدرات في ستراسبورغ لدعمه المالي.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
