JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

FLIM-FRET Измерения белково-белковых взаимодействий в живых бактериях.

Published: August 25, 2020
doi:
10.3791/61602
, , , , , , , , ,
1Université de Strasbourg,Laboratoire de Bioimagerie et Pathologies, UMR CNRS 7021, 2Université de Strasbourg, UMR 7242, ESBS, 3CNRS, UMR 7242, ESBS, 4Groupe Méthode Recherche Clinique,Hôpitaux Universitaires de Strasbourg

Summary

Мы описываем здесь протокол для характеристики белково-белковых взаимодействий между двумя сильно по-разному выраженными белками в живых Pseudomonas aeruginosa с использованием измерений FLIM-FRET. Протокол включает в себя бактерии штамма конструкций, бактерий иммобилизации, изображений и пост-изображения данных анализа процедур.

Abstract

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) контролируют различные ключевые процессы в клетках. Микроскопия флуоресценции в течение всей жизни (FLIM) в сочетании с переносом резонансной энергии Фюрстера (FRET) обеспечивает точную информацию о ИЦП в живых клетках. FLIM-FRET опирается на измерение распада флуоресценции донора FRET на каждом пикселе изображения FLIM, предоставляя количественную и точную информацию о ИЦП и их пространственных клеточных организациях. Мы предлагаем здесь подробный протокол для измерений FLIM-FRET, который мы применили для мониторинга ИЦП в живых Pseudomonas aeruginosa в конкретном случае двух взаимодействующих белков, выраженных с очень разными номерами копий, чтобы продемонстрировать качество и надежность метода при выявлении критических особенностей ИЦП. В этом протоколе подробно описаны все необходимые шаги для характеристики ИЦП – от бактериальных мутантных конструкций до окончательного анализа с использованием недавно разработанных инструментов, обеспечивающих расширенные возможности визуализации для простого толкования сложных данных FLIM-FRET.

Introduction

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) контролируют различные ключевые процессы вклетках 1. Роли ИЦП различаются в зависимости от состава белка, сродства функций и мест в клетках2. ИЦП могут быть исследованы с помощью различныхметодов 3. Например, ко-иммунопреципиентация является относительно простым, надежным и недорогим методом, широко используемым инструментом для выявления или подтверждения ИЦП. Тем не менее, изучение ИЦП может быть сложной задачей, когда взаимодействующие белки имеют низкий уровень экспрессии или когда взаимодействия являются переходными или актуальными только в конкретных средах. Изучение ИЦП, происходящих между различными ферментами пиовердина пути в P. aeruginosa требует, чтобы репрессии общего железа совместно фактором репрессора меха освобождается, чтобы выражение всех белков пиовердина путь, которые будут выражены вклетке 4,5,6. Эта общая регулировка для всех протеинов путя приводит к в своевременных выражениях в клетке, как ожидается, для содействия их взаимодействию. Разнообразие с зрения размера, природы, уровней экспрессии и количества белков этого метаболического пути затрудняет изучение в восстановленных системах6. Поэтому изучение ИЦП в их клеточной среде имеет решающее значение для дальнейшего понимания биологических функций белков в их родном контексте.

Лишь немногие методы, включая флуоресценцию позволяют исследовать ИЦП в живыхклетках 7. Среди различных параметров флуоресценции, которые могут быть измерены, срок службы флуоресценции (т.е. среднее время флюорофор остается в возбужденном состоянии, прежде чем излучать фотон), вероятно, является одним из самых интересных параметров для изучения в живых клетках. Срок службы флуоресценции флюорофора очень чувствителен к окружающей среде, и поэтому FLIM может предоставить химическую или физическую информацию о флюорофорнойсреде 8. Это включает в себя наличие Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET), которые могут возникнуть в присутствии “приемщика” флуоресценции, расположенной на небольшом расстоянии от флуоресценции “донор”. Передача энергии приводит к значительному сокращению срока службы донорской флуоресценции(рисунок 1A),что делает флуоресценцию пожизненной микроскопии (FLIM) мощным подходом к изучению белково-белковых взаимодействий непосредственно в живых клетках. FLIM может дополнительно предоставить пространственную информацию о том, где происходит взаимодействие вячейках 7,8. Такой подход чрезвычайно силен для изучения ИЦП в ситуациях, когда возможна маркировка флюорофорами двух взаимодействующих партнеров.

Для возникновения ФРЕТ – критические условия на расстоянии между двумя флюорофорамитребуются 8,9. Два фторфора не должны быть удалены друг от друга более чем на 10 нм. Поэтому при разработке экспериментов FLIM-FRET необходимо принимать предостережения, чтобы донор и приемник флуоресценции имели возможность находиться близко друг к другу в взаимодействующих комплексах. Хотя это может показаться сдерживающим, это на самом деле истинное преимущество, как расстояние зависимости FRET гарантирует, что два помеченных белков, проходящих FRET должны физически взаимодействовать (Рисунок 1A). Таким образом, трудности с получением четких ответов на вопросы о ИЦП в экспериментах по колокализации (два колокализованных белка не обязательно взаимодействуют) не являются проблемой с использованием FLIM-FRET.

Figure 1
Рисунок 1: Принцип анализа FLIM-FRET. Каждый пиксель многомерного изображения FLIM-FRET содержит информацию о распаде флуоресценции, зарегистрированном в данном конкретном месте (#counts – количество обнаруженных фотонов в канале t). (A) Классическое изображение FLIM, как правило, ложного цвета жизни закодированы 2D изображение (слева). Снижение среднего срока службы флуоресценции донора – как видно из изменения цветовой шкалы – можно наблюдать в присутствии ФРЕТ и является информативным о наличии ИЦП в этой пространственной области. (B) Перекрытие между спектром выбросов донора и спектром поглощения приемоктора необходимо для возникновения ФРЕТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Второе требование ДЛЯ ФРЕТ заключается в том, что спектр выбросов донора и спектр поглощения приемора должны перекрываться8 (рисунок 1B). Флуоресценция возбуждения донора должна быть на длинах волн, которые вносят очень мало в прямое возбуждение флуоресценции приемора. Не все комбинации флюорофоров возможны, и мы дополнительно рекомендуем преимущественно использовать доноров с моноэкспонентным распадом флуоресценции для облегчения интерпретаций FLIM-FRET10. Несколько пар белков флуоресценции отвечают этим требованиям, в том числе популярная пара eGFP-mCherry11 (для обзора палитры доступных флуоресцентных белковых пар FRETсм. 12,13).

FLIM-FRET позволяет измерять упадок флуоресценции донора FRET на каждом пикселе изображения FLIM(рисунок 1A). Существуют два основных метода определения срока службы флуоресценции, которые отличаются по приобретению и анализу: частотный домен (FD)14 и домен времени (TD). TD FLIM является более распространенным и осуществляется с использованием импульсного освещения в сочетании с различными возможными конфигурациями обнаружения, включая gatingметоды 15, полосакамеры 16 или времени коррелированных одного фотона подсчета (TCSPC)методы 8. Как для методов FD, так и для TD срок службы флуоресценции непосредственно не измеряется, а требует анализа измеренных данных для оценки продолжительности жизни (ы) или наличия взаимодействий. Для методов TCSPC наиболее широко используемый анализ основывается на установке распада с помощью одной или нескольких экспоненциальных функций с использованием наименее квадратных итеративных революций, которые минимизируют взвешенную сумму остатков.

Наконец, FLIM-FRET может быть выполнен как с помощью одного фотона или мультифотонных возбуждений. Последние имеют ряд преимуществ, таких как уменьшение аутофторесценции и фотодемаж из фокусной плоскости. Мультифотонные возбуждения позволяют также более длинную глубину возбуждения при работе в толстых 3D образцах8. Напротив, одно фотон возбуждение, как правило, более эффективным, как два фотона поглощения поперечных сечений флуоресцентных белковограничены 17.

Здесь мы предлагаем протокол для измерений ИЦП FLIM-FRET в живых P. aeruginosa в конкретном случае двух взаимодействующих белков (PvdA и PvdL), выраженных с очень разным количеством копий, чтобы продемонстрировать качество и надежность метода при выявлении критических особенностей ИЦП. Белки PvdA и PvdL участвуют в биосинтезе пиовердина. PvdA является L-орнитин N5-оксигеназа и синтезирует L-N5-формил-N5-гидроксиорнитин из L-орнитин по гидроксилации (PvdA) и формилирования (PvdF)18. PvdL является не рибосомным пептидным синтезом (NRPS) ферментом, состоящим из четырех модулей. Первый модуль катализает ациляцию миристической кислоты. Второй модуль катализает активацию L-Glu и его конденсации в миристический коА. Затем третий модуль конденсирует аминокислоту L-Tyr, которая затем изомерируется в D-Tyr. Наконец, четвертый модуль связывает L-Dab (Diaminobutyric кислоты) аминокислоты для формирования ацилатного трипептида L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL, таким образом, отвечает за синтез трех первых аминокислот прекурсора пиовердина. Взаимодействие белка PvdA с PvdL удивительно, так как PvdL, в отличие от PvdI и PvdJ, не несет модуль, специфичный для L-N5-formyl-N5-гидроксиорнитин. Это взаимодействие предполагает, что все ферменты, ответственные за биосинтез прекурсора пиовердина, расположены в больших переходных и динамическихмногоэнзиматических комплексах 19,20.

В этом докладе мы подробно объяснить, как построить бактериальных штаммов, выражаюющих родной двух взаимодействующих eGFP и mCherry помечены белками. Мы также описываем подготовку образцов и условия для эффективной визуализации клеток FLIM-FRET. Наконец, мы предлагаем пошаговую учебную программу для анализа изображений, включая недавно разработанный инструмент, предоставляющий расширенные возможности визуализации для простого толкования сложных данных FLIM-FRET. С помощью этого доклада мы хотели бы убедить не только предприимчивых, но и большинство биологов в том, что FRET-FLIM является доступным и мощным методом, способным решать свои вопросы о ИЦП непосредственно в родной клеточной среде.

Protocol

1. Плазмидная конструкция Усиление двумя ПЦР (ПЦР1 и 3) последовательностей ДНК (использование геномной ДНК P. aeruginosa PAO1) из 700 базовых пар вверх и вниз по течению регионов, соответствующих месту вставки в геноме P. aeruginosa с полимеразой ДНК высокой точности. Добавьте сайты огран…

Representative Results

Эмпирические кумулятивные функции распределения (ecdf) жизней флуоресценции, измеренные для различных бактериальных штаммов, показаны на рисунке 8. Если ПРОИСХОДИТ ФРЕТ, экдфы смещаются в сторону более короткой продолжительности жизни(рисунок 8A.8B).</st…

Discussion

FLIM-FRET предлагает некоторые ключевые преимущества по сравнению с интенсивностью на основе изображений FRET. Срок службы флуоресценции является неотъемлемым параметром флюорофора. Как следствие, он не зависит ни от локальных концентраций фторфоров, ни от интенсивности возбуждения света….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы признательны д-ру Людовику Ричерту за его ценную помощь в сборе данных FLIM, а также в техническом обслуживании и разработке установки FLIM. Эта работа финансировалась за счет грантов фонда pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN финансируется Фондом за Recherche M’dicale (FRM-SPF201809006906). YM признателен Институту Франции (IUF) за поддержку и предоставление дополнительного времени для исследований. IJS и JG признают Институт по доставке наркотиков в Страсбурге за его финансовую поддержку.

Materials

525/50 nm band-pass filter F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter F75-680, AHF, Germany
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL ThermoFisher Scientific EP0714
E. coli TOP10 Invitrogen C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm Knitel glass MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL ThermoFisher Scientific F530S
Lysogeny broth (LB) Millipore 1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) Sigma-Aldrich 10034-99-8
Microscope slides (25×75mm) Knitel glass MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.50
NucleoSpin Plasmid Macherey-Nagel 740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) Sigma-Aldrich RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655
Sodium Succinate (Disodium) Sigma-Aldrich 14160
SPCImage, SPCM software Becker & Hickl
Sterile inoculating loop Nunc 7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL ThermoFisher Scientific 15224017
TCSPC module SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL Falcon 352070
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
  3. Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
  4. Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
  5. Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
  6. Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
  7. Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
  8. Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
  9. Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
  10. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
  11. Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
  12. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
  14. Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
  15. Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
  16. Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
  18. Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
  19. Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
  20. Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
  21. Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
  22. Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
  23. Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
  24. El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
  25. Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
  26. Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
  27. Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  28. Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
  29. Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
  31. Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
  32. Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
  33. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
  34. Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  35. Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
  36. Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
  37. Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
  38. Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
  39. Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
  40. Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
  41. Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
  42. Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).

Tags

FLIM-FRETProtein-protein InteractionsLive BacteriaLive CellsP.aeruginosaE.coliFluorescent ProteinsMicroscopyAgaroseGentamycin
check_url/61602?article_type=t&slug=flim-fret-measurements-protein-protein-interactions-live

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manko, H., Normant, V., Perraud, Q., Steffan, T., Gasser, V., Boutant, E., Réal, É., Schalk, I. J., Mély, Y., Godet, J. FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.. J. Vis. Exp. (162), e61602, doi:10.3791/61602 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image