活细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的FLIM-FRET测量。
Summary
我们在此描述一个协议，使用FLIM-FRET测量来描述活 伪多 西诺萨中两种高度不同的表达蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。该协议包括细菌菌株结构、细菌固定、成像和成像后数据分析程序。
Abstract
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）控制细胞中的各种关键过程。荧光寿命成像显微镜 （FLIM） 与 Fürster 共振能量转移 （FRET） 相结合，提供有关活细胞中 PPI 的准确信息。FLIM-FRET 依靠测量 FLIM 图像每个像素的 FRET 捐赠者的荧光寿命衰减，提供有关 PPI 及其空间细胞组织的定量和准确信息。我们在此为 FLIM-FRET 测量提出了详细的协议，我们用于监测活的伪多 多 尼亚亚鲁吉诺萨的 PPI，在两种相互作用的蛋白质用非常不同的拷贝数表示的特定情况下，以演示该技术在揭示PPI关键特征方面的质量和鲁棒性。该协议详细描述了 PPI 表征的所有必要步骤 – 从细菌突变结构到最终分析，使用最近开发的工具，为直接解释复杂的 FLIM-FRET 数据提供高级可视化可能性。
Introduction
蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）控制细胞1中的各种关键过程。PPI的作用因蛋白质组成、亲缘功能和细胞2中的位置而不同。PPI可以通过不同的技术3进行调查。例如，共免疫沉淀是一种相对简单、可靠且廉价的技术，常用工具来识别或确认 PPI。然而，当相互作用的蛋白质表达水平较低，或者相互作用是瞬态的或仅在特定环境中相关时，研究PPI可能具有挑战性。研究在P.aeruginosa中皮奥弗丁通路的不同酶之间发生的PPI要求释放一般铁共因子抑制剂毛皮的抑制，使皮奥弗丁通路的所有蛋白质的表达在细胞4、5、6中表达。这种对通路所有蛋白质的共同调节导致细胞中的及时表达，预期促进其相互作用。这种代谢途径的大小、性质、表达水平和蛋白质数量的多样性使得在重组系统6中难以研究。因此，在细胞环境中探索PPI对于进一步了解蛋白质在本土环境中的生物功能至关重要。
只有少数方法，包括荧光，允许探索PPI在活细胞7。在可以测量的不同荧光参数中，荧光寿命（即荧光团在发射光子之前保持兴奋状态的平均时间）可能是活细胞中最有趣的参数之一。荧光团的荧光寿命对氟化物的环境高度敏感，因此，FLIM可以提供有关荧光团周围环境的化学或物理信息。这包括在荧光”捐赠者”的短距离存在荧光的”接受器”时可能发生的Fürster共振能量转移（FRET）。能量转移显著缩短了供体荧光寿命（图1A），使荧光寿命成像显微镜（FLIM）成为直接在活细胞中探索蛋白质-蛋白质相互作用的有力方法。FLIM还可以提供有关在细胞7、8中相互作用发生位置的空间信息。这种方法对于在两个相互作用的伙伴的荧光标记可能的情况下调查PPI非常强大。
对于F FRET发生 – 两个荧光团之间的距离的关键条件需要8，9。两个荧光团之间不应相距超过 10 nm。因此，在设计FLIM-FRET实验时，必须谨慎行事，以确保荧光的供体和接受方有机会在相互作用的复合体中彼此靠近。虽然这似乎有限制，但事实上，它是真正的优势，因为F FRET的远距离依赖性确保了两个标签的蛋白质进行F FRET必须物理相互作用（图1A）。因此，在结肠化实验中获得关于PPI的清晰答案（两种结肠化蛋白质不一定相互作用）的困难不是使用FLIM-FRET的问题。
图1：FLIM-FRET分析原理。FLIM-FRET 多维图像的每个像素都包含有关在此特定位置记录的荧光衰减的信息（#counts = 通道 t 中检测到的光子数量）。（A） FLIM 图像的经典表示形式通常是一个假彩色寿命编码的 2D 图像（左）。在F FRET存在的情况下，可以观察到捐赠者平均荧光寿命的降低，这可以从颜色刻度的变化中观察到，并且对该空间区域中PPI的存在有信息性。（B） 供体发射谱与接受方吸收光谱之间的重叠是F FRET发生所必需的。 请单击此处查看此图的较大版本。
FRET 的第二个要求是供体的排放光谱和接受方的吸收光谱应重叠8（图 1B）。供体荧光激发的波长对接受器的直接荧光激发贡献很小。不是所有的荧光团组合都是可能的，我们还建议优先使用单一过期荧光衰变的捐赠者，以方便FLIM-FRET解释10。几对荧光蛋白夫妇满足这些要求，包括流行的eGFP-mCherry夫妇11（如审查可用荧光蛋白F FRET对的调色板见12，13）。
FLIM-FRET 允许测量 FRET 捐赠者在 FLIM 图像的每个像素的荧光寿命衰减（图 1A）。在采集和分析方面，有两种确定荧光寿命的主要技术：频域 （FD）14 和时域 （TD）。TD FLIM 是更广泛的，并使用脉冲照明结合不同的可能的检测配置，包括浇注方法15，条纹相机16 或时间相关的单光子计数 （TCSPC） 技术8。对于 FD 和 TD 技术，荧光寿命不是直接测量的，而是需要对测量数据进行分析，以估计寿命或相互作用的存在。对于 TCSPC 技术，使用最广泛的分析依赖于使用单指数函数或多指数函数对衰减进行拟合，使用最少的方形迭代重卷积，从而最大限度地减少残差的加权和。
最后，FLIM-FRET 可以通过使用单光子或多光子激动来执行。最新的有几个优点，如减少自荧光和光伤害的焦点平面。多光子激发也允许更长的激发深度，如果工作在厚3D样本8。相反，单光子激发通常效率更高，因为荧光蛋白的两光子吸收横截面是有限的17。
在这里，我们提出了一个协议，在两种相互作用的蛋白质（PvdA和PvdL）的特例中，FLIM-FRET测量PPI，用非常不同数量的拷贝表达，以证明该技术在揭示PPI关键特征方面的质量和鲁棒性。PvdA 和 PvdL 蛋白质参与皮奥弗丁生物合成。PvdA 是一种 L-ornithine N5-氧酶，通过羟基化 （PvdA） 和相化 （PvdF）18从 L-ornithine 合成 L-N5-formyl-N5-羟基磷酸烷。PvdL 是一种非核糖体肽合成 （NRPS） 酶，由四个模块组成。第一个模块催化甲酸的催化。第二个模块催化L-Glu的激活及其凝结到三元共体。然后，第三个模块凝结L-Tyr氨基酸，然后在D-Tyr中异构。最后，第四个模块结合L-Dab（硅丁酸）氨基酸，形成丙烯酸三肽L-Glu/D-Tyr/L-Dab6。因此，PvdL 负责合成皮多非丁前体的三个第一个氨基酸。PvdA蛋白与PvdL的相互作用令人惊讶，因为与PvdI和PvdJ相反，PvdL没有携带一个特定于L-N5-formyl-N5-羟基诺尼辛的模块。这种相互作用表明，所有负责皮奥弗丁前体生物合成的酶都排列在大型瞬态和动态多酶复合物19、20中。
在这份报告中，我们详细解释了如何构建本地表达两种相互作用的eGFP和mCherry标记蛋白的细菌菌株。我们还描述了有效 FLIM-FRET 细胞成像的样品制备和条件。最后，我们提出了图像分析的分步教程，包括最近开发的工具，为直接解释复杂的 FLIM-FRET 数据提供了高级可视化可能性。通过这份报告，我们不仅想说服冒险，而且让大多数生物学家相信，FRET-FLIM是一种易于访问和强大的技术，能够直接在本地细胞环境中解决他们关于PPI的问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
与基于强度的 FRET 成像相比，FLIM-FRET 具有一些关键优势。荧光寿命是荧光的固有参数。因此，它既不依赖于局部浓度的荧光团，也不依赖于光激发的强度。此外，荧光寿命也受到光漂白的影响。特别有趣的是，在细胞中，局部蛋白质的浓度在整个亚细胞隔间或区域中具有高度异质性。FLIM-FRET 也很有趣，在所有复杂浓度低的情况下，因为蛋白质或其中一种蛋白质的表达水平都很低。
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢卢多维奇·里赫特博士在 FLIM 数据采集以及 FLIM 设置的技术维护和开发方面提供的宝贵帮助。这项工作的资金来自奇米基金会（https://icfrc.fr/）。VN由墨西哥教育基金会（FRM+SPF201809006906）资助。基督教青年会感谢法国大学研究所（IUF）的支持和提供更多时间专门从事研究。IJS和JG感谢斯特拉斯堡药物供应研究所的财政支持。
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
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