Mesures FLIM-FRET des interactions protéines-protéines chez les bactéries vivantes.

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour caractériser les interactions protéine-protéine entre deux protéines fortement exprimées différemment dans pseudomonas aeruginosa vivants utilisant des mesures de FLIM-FRET. Le protocole comprend les constructions de souches bactériennes, l’immobilisation des bactéries, l’imagerie et les routines d’analyse des données post-imagerie.

Abstract

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules. La microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) combinée au transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) fournissent des informations précises sur les IPP dans les cellules vivantes. FLIM-FRET s’appuie sur la mesure de la désintégration à vie par fluorescence d’un donneur fret à chaque pixel de l’image FLIM, fournissant des informations quantitatives et précises sur les IPP et leurs organisations cellulaires spatiales. Nous proposons ici un protocole détaillé pour les mesures FLIM-FRET que nous avons appliqué pour surveiller les IPP en direct Pseudomonas aeruginosa dans le cas particulier de deux protéines en interaction exprimées avec des numéros de copie très différents pour démontrer la qualité et la robustesse de la technique à révéler les caractéristiques critiques des IPP. Ce protocole décrit en détail toutes les étapes nécessaires à la caractérisation ppi – à partir de constructions mutantes bactériennes jusqu’à l’analyse finale à l’aide d’outils récemment développés offrant des possibilités avancées de visualisation pour une interprétation simple des données complexes FLIM-FRET.

Introduction

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules¹. Les rôles des IPP diffèrent en fonction de la composition protéique, des fonctions d’affinités et des emplacements dans les^{cellules 2}. Les IPP peuvent être étudiés au moyen de différentes techniques³. Par exemple, la co-immunoprécipitation est un outil relativement simple, robuste et peu coûteux couramment utilisé pour identifier ou confirmer les IPP. Toutefois, l’étude des IPP peut s’avérer difficile lorsque les protéines en interaction ont de faibles niveaux d’expression ou lorsque les interactions sont transitoires ou pertinentes uniquement dans des environnements spécifiques. L’étude des IPP se produisant entre les différentes enzymes de la voie de pyoverdine dans P. aeruginosa exige que la répression du répresseur général fer-co-factorisé Fur soit soulagée pour permettre l’expression de toutes les protéines de la voie de pyoverdine pour être exprimée dans la cellule^4,5,6. Cette régulation commune pour toutes les protéines de la voie entraîne des expressions opportunes dans la cellule qui devrait favoriser leurs interactions. La diversité en termes de taille, de nature, de niveaux d’expression et le nombre de protéines de cette voie métabolique rendent difficile l’étude dans les systèmes reconstitués⁶. Il est donc essentiel d’explorer les IPP dans leur environnement cellulaire pour mieux comprendre les fonctions biologiques des protéines dans leur contexte natal.

Seules quelques méthodes, y compris la fluorescence, permettent d’explorer les IPP dans les cellules^{vivantes 7}. Parmi les différents paramètres de fluorescence qui peuvent être mesurés, la durée de vie de fluorescence (c.-à-d. le temps moyen qu’un fluorophore reste dans son état excité avant d’émettre un photon) est probablement l’un des paramètres les plus intéressants à explorer dans les cellules vivantes. La durée de vie de fluorescence d’un fluorophore est très sensible à son environnement et FLIM peut donc fournir des informations chimiques ou physiques concernant l’environnement fluorophore⁸. Cela inclut la présence d’un transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) qui peut se produire en présence d’un « accepteur » de fluorescence situé à une courte distance d’un « donneur » de fluorescence. Le transfert d’énergie entraîne un raccourcissement important de la durée de vie de fluorescence du donneur (figure 1A), faisant de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) une approche puissante pour explorer les interactions protéine-protéine directement dans les cellules vivantes. FLIM peut en outre fournir des informations spatiales sur l’endroit où les interactions ont lieu dans^{les cellules 7,8}. Cette approche est extrêmement puissante pour étudier les IPP dans les situations où l’étiquetage avec les fluorophores des deux partenaires en interaction est possible.

Pour fret de se produire – conditions critiques sur la distance entre deux fluorophores sont nécessaires^8,9. Les deux fluorophores ne doivent pas être éloignés l’un de l’autre de plus de 10 nm. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lors de la conception d’expériences FLIM-FRET pour s’assurer que le donneur et l’accepteur de fluorescence ont une chance d’être situés l’un près de l’autre dans le complexe en interaction. Bien que cela puisse sembler contraignant, il s’agit en fait d’un véritable avantage, car la dépendance à distance du FRET fait en sorte que deux protéines étiquetées subissant fret doivent interagir physiquement (Figure 1A). Les difficultés à obtenir des réponses claires sur l’IPP dans les expériences de colocalisation (deux protéines colocalisées peuvent ne pas nécessairement interagir) ne sont donc pas un problème à l’aide de FLIM-FRET.

Figure 1 : Principe d’analyse FLIM-FRET. Chaque pixel de l’image multidimensionnelle FLIM-FRET contient des informations sur la désintégration de fluorescence enregistrée à cet endroit particulier (#counts = nombre de photons détectés dans le canal t). (R) La représentation classique de l’image FLIM est généralement une image 2D codée à vie en fausse couleur (à gauche). Une diminution de la durée de vie moyenne de fluorescence du donneur – comme en voit un changement dans l’échelle des couleurs – peut être observée en présence de FRET et est instructive sur la présence d’IPP dans cette zone spatiale. ( B )Unchevauchement entre le spectre des émissions des donneurs et le spectre d’absorption de l’accepteur est nécessaire pour que le FRET se produise. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Une deuxième exigence du FRET est que le spectre d’émission du donneur et les spectres d’absorption de l’accepteur se^{chevauchent 8} (figure 1B). L’excitation de fluorescence du donneur doit être à des longueurs d’onde qui contribuent très peu à l’excitation directe de fluorescence de l’accepteur. Toutes les combinaisons de fluorophores ne sont pas possibles et nous recommandons en outre d’utiliser préférentiellement les donneurs ayant des désintégrations monoexponentielles de fluorescence pour faciliter les interprétations flim-FRET¹⁰. Plusieurs couples de protéines de fluorescence répondent à ces exigences, y compris le populaire couple eGFP-mCherry¹¹ (pour un examen sur la palette de protéines fluorescentes disponibles fret paires^{voir 12,13}).

FLIM-FRET permet de mesurer la désintégration à vie par fluorescence d’un donneur fret à chaque pixel d’une image FLIM (Figure 1A). Il existe deux techniques majeures pour déterminer la durée de vie de la fluorescence qui diffèrent dans l’acquisition et l’analyse : le domaine de fréquence (FD)¹⁴ et le domaine du temps (TD). TD FLIM est plus répandue et est effectuée à l’aide d’un éclairage pulsé combiné avec différentes configurations de détection possibles, y compris les méthodes de gating¹⁵,^{strie caméra 16} ou en corrélation avec le temps simple comptage des photons (TCSPC) techniques⁸. Tant pour les techniques de DF que pour les techniques de DT, la durée de vie de la fluorescence n’est pas mesurée directement, mais nécessite une analyse des données mesurées pour estimer la durée de vie ou la présence d’interactions. Pour les techniques tcspc, l’analyse la plus largement utilisée repose sur l’ajustement des désintégrations avec des fonctions exponentielles simples ou multiples en utilisant les reconvolutions itératives les moins carrées qui minimisent la somme pondérée des résidus.

Enfin, FLIM-FRET peut être effectué à la fois en utilisant un seul photon ou excitations multiphoton. Les derniers ont plusieurs avantages comme la réduction de l’autofluorescence et photodamage hors du plan focal. Les excitations multiphoton permettent également une plus longue profondeur d’excitation si l’on travaille dans des échantillons 3D^{épais 8}. Au contraire, l’excitation simple de photons est habituellement plus efficace car les sections transversales d’absorption de deux photons des protéines fluorescentes sont^{limitées 17.}

Ici, nous proposons un protocole pour les mesures FLIM-FRET des IPP en direct P. aeruginosa dans le cas particulier de deux protéines en interaction (PvdA et PvdL) exprimées avec un nombre très différent de copies pour démontrer la qualité et la robustesse de la technique à révéler les caractéristiques critiques des IPP. Les protéines PvdA et PvdL sont impliquées dans la biosynthèse de la pyoverdine. PvdA est un L-ornithine N5-oxygenase et synthétise le L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine de L-ornithine par hydroxylation (PvdA) et formylation (PvdF)¹⁸. Le PvdL est une enzyme de synthèse peptidique non ribosomique (NRPS) composée de quatre modules. Le premier module catalyse l’acylation de l’acide myristique. Le deuxième module catalyse l’activation de L-Glu et sa condensation vers le myristic-coA. Ensuite, le troisième module condense un acide aminé L-Tyr qui est ensuite isomérisé en D-Tyr. Enfin, le quatrième module lie un acide aminé L-Dab (acide diaminobutyrique) pour former le tripepide acylé L-Glu/D-Tyr/L-Dab⁶. PvdL est donc responsable de la synthèse des trois premiers acides aminés du précurseur de la pyoverdine. L’interaction de la protéine PvdA avec le PvdL est surprenante car le PvdL, au contraire du PvdI et du PvdJ, ne porte pas de module spécifique à la L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. Cette interaction suggère que toutes les enzymes responsables de la biosynthèse précurseur de la pyoverdine sont disposées dans de grands complexes multi-enzymatiques transitoires et^{dynamiques 19,20}.

Dans ce rapport, nous expliquons en détail comment construire les souches bactériennes exprimant nativement les deux protéines étiquetées eGFP et mCherry en interaction. Nous décrivons également la préparation de l’échantillon et les conditions d’imagerie cellulaire FLIM-FRET efficace. Enfin, nous proposons un didacticiel étape par étape pour l’analyse d’images, y compris un outil récemment développé offrant des possibilités avancées de visualisation pour une interprétation simple des données complexes FLIM-FRET. Avec ce rapport, nous tenons à convaincre non seulement les aventuriers, mais la plupart des biologistes que FRET-FLIM est une technique accessible et puissante capable de répondre à leurs questions sur les IPP directement dans l’environnement cellulaire natif.

Protocol

1. Construction plasmide Amplifier par deux PCR (PCR1 et 3) les séquences d’ADN (utiliser l’ADN génomique de P. aeruginosa PAO1) des 700 paires de base en amont et en aval des régions correspondant au site d’insertion dans le génome de P. aeruginosa avec polymése d’ADN haute fidélité. Ajouter des sites de restriction aux amorces en bleu et vert et ajouter une séquence qui se chevauche avec mCherry aux amorces en rouge( Figure 2). Pour le Pv…

Representative Results

Les fonctions cumulatives empiriques de distribution (ecdf) des durées de vie de fluorescence mesurées pour les différentes souches bactériennes sont indiquées à la figure 8. Si fret se produit, les ecdfs sont déplacés vers les durées de vie plus courtes(figure 8A,8B). Notez que lorsque l’interaction des deux protéines entraîne une longue distance entre les deux fluorophores, aucun FRET ne peut se produire (Figu…

Discussion

FLIM-FRET offre certains avantages clés par rapport à l’imagerie FRET basée sur l’intensité. La durée de vie de fluorescence est un paramètre intrinsèque du fluorophore. Par conséquent, elle ne dépend pas des concentrations locales de fluorophores ni de l’intensité de l’excitation lumineuse. La durée de vie de fluorescence est en outre également mal affectée par le photo-blanchiment. Il est particulièrement intéressant de mettre en évidence les IPP dans les cellules où les concentrations de prot?…

Materials

525/50 nm band-pass filter	F37-516, AHF, Germany
680 nm short pass filter	F75-680, AHF, Germany
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A4418
DreamTaq DNA polymerase 5U/μL	ThermoFisher Scientific	EP0714
E. coli TOP10	Invitrogen	C404010
Fiber-coupled avalanche photo-diode	SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer
Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm	Knitel glass	MS0011
High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL	ThermoFisher Scientific	F530S
Lysogeny broth (LB)	Millipore	1.10285
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O)	Sigma-Aldrich	10034-99-8
Microscope slides (25×75mm)	Knitel glass	MS0057
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.50
NucleoSpin Plasmid	Macherey-Nagel	740588.10
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	RES20765
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Succinate (Disodium)	Sigma-Aldrich	14160
SPCImage, SPCM software	Becker & Hickl
Sterile inoculating loop	Nunc	7648-1PAK
T4 DNA ligase 1U/μL	ThermoFisher Scientific	15224017
TCSPC module	SPC830, Becker & Hickl, Germany
Ti:Sapphire laser	Insight DeepSee, Spectra Physics
Tubes 50mL	Falcon	352070