FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.
Summary
Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei stark unterschiedlich exprimierenden Proteinen in lebenden Pseudomonas aeruginosa mit FLIM-FRET-Messungen. Das Protokoll umfasst Bakterienstammkonstruktionen, Bakterienimmobilisierung, Bildgebung und Nach-Imaging-Datenanalyseroutinen.
Abstract
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen. Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) in Kombination mit Förster Resonanzenergietransfer (FRET) liefern genaue Informationen über PPI in lebenden Zellen. FLIM-FRET stützt sich auf die Messung des Fluoreszenz-Lebensdauerzerfalls eines FRET-Spenders an jedem Pixel des FLIM-Bildes und liefert quantitative und genaue Informationen über PPI und ihre räumlichen zellulären Organisationen. Wir schlagen hier ein detailliertes Protokoll für FLIM-FRET-Messungen vor, das wir zur Überwachung von PPI in lebenden Pseudomonas aeruginosa im speziellen Fall von zwei interagierenden Proteinen angewendet haben, die mit sehr unterschiedlichen Kopiernummern ausgedrückt werden, um die Qualität und Robustheit der Technik bei der Aufdeckung kritischer Merkmale von PPI zu demonstrieren. Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle notwendigen Schritte für die PPI-Charakterisierung – von bakteriellen Mutantenkonstruktionen bis zur Endanalyse mit neu entwickelten Tools, die erweiterte Visualisierungsmöglichkeiten für eine einfache Interpretation komplexer FLIM-FRET-Daten bieten.
Introduction
Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) steuern verschiedene Schlüsselprozesse in Zellen1. Die Rollen von PPI unterscheiden sich je nach Proteinzusammensetzung, Affinitätsfunktionen und Positionen in Zellen2. PPI können mit verschiedenen Techniken untersucht werden3. Beispielsweise ist Die Co-Immunpräzipitation ein relativ einfaches, robustes und kostengünstiges, häufig verwendetes Werkzeug zur Identifizierung oder Bestätigung von PPI. Das Studium von PPI kann jedoch eine Herausforderung sein, wenn die interagierenden Proteine einen niedrigen Expressionsgrad aufweisen oder wenn die Wechselwirkungen nur in bestimmten Umgebungen vorübergehend oder relevant sind. Die Untersuchung von PPIs, die zwischen den verschiedenen Enzymen des Pyoverdin-Signalwegs in P. aeruginosa auftreten, erfordert, dass die Unterdrückung des allgemeinen eisenkofaktorierten Repressors Fur entlastet wird, damit die Expression aller Proteine des Pyoverdinwegs in der Zelle4,5,6ausgedrückt werden kann. Diese gemeinsame Regulierung für alle Proteine des Pfades führt zu rechtzeitigen Ausdrücken in der Zelle, von der erwartet wird, dass sie ihre Wechselwirkungen fördert. Die Vielfalt in Umfang, Natur, Expressionsniveaus und die Anzahl der Proteine dieses Stoffwechselwegs erschweren die Untersuchung in rekonstituierten Systemen6. Die Erforschung von PPI in ihrer zellulären Umgebung ist daher entscheidend, um die biologischen Funktionen von Proteinen in ihrem nativen Kontext besser zu verstehen.
Nur wenige Methoden, einschließlich Fluoreszenz, erlauben die Untersuchung von PPI in lebenden Zellen7. Unter den verschiedenen Fluoreszenzparametern, die gemessen werden können, ist die Fluoreszenzlebensdauer (d. h. die durchschnittliche Zeit, in der ein Fluorophor in seinem angeregten Zustand verbleibt, bevor ein Photon emittiert wird) wahrscheinlich einer der interessantesten Parameter, um in lebenden Zellen zu erforschen. Die Fluoreszenzlebensdauer eines Fluorophors ist sehr umweltempfindlich und FLIM kann daher chemische oder physikalische Informationen über die Fluorophorumgebung8liefern. Dazu gehört auch das Vorhandensein von Förster Resonanzenergietransfer (FRET), die in Gegenwart eines “Akzeptors” der Fluoreszenz in kurzer Entfernung eines Fluoreszenz-“Spenders” auftreten kann. Energietransfer führt zu einer signifikanten Verkürzung der Spenderfluoreszenzlebensdauer (Abbildung 1A), was die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) zu einem leistungsstarken Ansatz zur Erforschung von Protein-Protein-Wechselwirkungen direkt in lebenden Zellen macht. FLIM kann zusätzlich räumliche Informationen darüber bereitstellen, wo die Wechselwirkungen in den Zellen7,8stattfinden. Dieser Ansatz ist äußerst leistungsfähig für die Untersuchung von PPI in Situationen, in denen die Kennzeichnung mit Fluorophoren der beiden interagierenden Partner möglich ist.
Damit FRET auftritt – kritische Bedingungen auf dem Abstand zwischen zwei Fluorophoren sinderforderlich 8,9. Die beiden Fluorophore sollten nicht um mehr als 10 nm voneinander entfernt sein. Daher ist bei der Entwicklung von FLIM-FRET-Experimenten Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass der Spender und der Fluoreszenzak eine Chance haben, sich im interagierenden Komplex nahe beieinander zu befinden. Obwohl dies einschränkend erscheinen mag, ist es in der Tat ein echter Vorteil, da die Entfernungsabhängigkeit von FRET sicherstellt, dass zwei markierte Proteine, die SICH FRET unterziehen, physisch interagieren müssen (Abbildung 1A). Die Schwierigkeiten, klare Antworten über PPI in Kolokalisierungsexperimenten zu erhalten (zwei kolokalisierte Proteine können nicht unbedingt interagieren) sind daher kein Problem mit FLIM-FRET.
Abbildung 1: FLIM-FRET-Analyseprinzip. Jedes Pixel des mehrdimensionalen FLIM-FRET-Bildes enthält Informationen über den fluoreszenzzerfall, der an dieser bestimmten Stelle aufgezeichnet wurde (#counts = Anzahl der erkannten Photonen im Kanal t). (A) Die klassische Darstellung des FLIM-Bildes ist in der Regel ein falschfarbiges, kodiertes 2D-Bild (links). Eine Abnahme der mittleren Fluoreszenzlebensdauer des Spenders – wie durch eine Änderung der Farbskala gesehen – kann in Gegenwart von FRET beobachtet werden und ist informativ über das Vorhandensein von PPI in diesem räumlichen Bereich. (B) Für FRET ist eine Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum des Gebers und dem Absorptionsspektrum des Gebers erforderlich. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Eine zweite Voraussetzung für FRET ist, dass sich das Emissionsspektrum des Spenders und die Absorptionsspektren des Akzeptors überlappen 8 (Abbildung 1B). Die Fluoreszenzerregung des Spenders sollte bei Wellenlängen erfolgen, die sehr wenig zur direkten Fluoreszenzerregung des Akzeptors beitragen. Nicht alle Kombinationen von Fluorophoren sind möglich und wir empfehlen zusätzlich, bevorzugt Spender mit monoexponentiellen Fluoreszenzzerfallen zu verwenden, um FLIM-FRET-Interpretationen zu erleichtern10. Mehrere Paare von Fluoreszenzproteinen erfüllen diese Anforderungen, einschließlich des beliebten eGFP-mCherry-Paares11 (für einen Überblick über die Palette des verfügbaren fluoreszierenden Proteins FRET-Paare siehe12,13).
FLIM-FRET ermöglicht die Messung des Fluoreszenz-Lebensdauerzerfalls eines FRET-Spenders an jedem Pixel eines FLIM-Bildes (Abbildung 1A). Es gibt zwei Haupttechniken zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer, die sich bei der Erfassung und Analyse unterscheiden: Frequency-Domain (FD)14 und Time-Domain (TD). TD FLIM ist weiter verbreitet und wird mit einer gepulsten Beleuchtung in Kombination mit verschiedenen möglichen Detektionskonfigurationen durchgeführt, einschließlich Der Gating-Methoden15, Streifenkamera16 oder zeitkorrelierten Single Photon Counting (TCSPC) Techniken8. Sowohl bei FD- als auch bei TD-Techniken wird die Fluoreszenzlebensdauer nicht direkt gemessen, sondern erfordert eine Analyse der gemessenen Daten, um die Lebensdauer(en) oder das Vorhandensein von Wechselwirkungen zu schätzen. Bei TCSPC-Techniken beruht die am weitesten verbreitete Analyse auf der Anpassung der Zerfälle mit einzelnen oder multiexponentiellen Funktionen unter Verwendung der am wenigsten quadratischen iterativen Revolutionen, die die gewichtete Summe der Residuen minimieren.
Schließlich kann FLIM-FRET sowohl mit einzelnen Photonen- als auch mit Multiphotonen-Erregungen durchgeführt werden. Die neuesten haben mehrere Vorteile wie die Reduzierung von Autofluoreszenz und Photoschaden aus dem Brennflugzeug. Multiphotonen-Erregungen ermöglichen auch eine längere Anregungstiefe, wenn sie in dicken 3D-Probenarbeiten 8. Im Gegenteil, einzelne Photonenanregung ist in der Regel effizienter, da die zwei Photonen Absorption spirationsübergreifende von fluoreszierenden Proteinen begrenzt sind17.
Hier schlagen wir ein Protokoll für FLIM-FRET-Messungen von PPI in Live-P. aeruginosa im speziellen Fall von zwei interagierenden Proteinen (PvdA und PvdL) vor, die mit sehr unterschiedlicher Anzahl von Kopien ausgedrückt werden, um die Qualität und Robustheit der Technik bei der Aufdeckung kritischer Merkmale von PPI zu demonstrieren. PvdA- und PvdL-Proteine sind an der Pyoverdin-Biosynthese beteiligt. PvdA ist eine L-Ornithin-N5-Sauerstoffase und synthetisiert das L-N5-Formyl-N5-Hydroxyornithin aus L-Ornithin durch Hydroxylierung (PvdA) und Formylierung (PvdF)18. PvdL ist ein nicht-ribosomales Peptidsyntheseenzym (NRPS), das aus vier Modulen besteht. Das erste Modul katalysiert die Acylation von Myristinsäure. Das zweite Modul katalysiert die Aktivierung von L-Glu und dessen Kondensation auf das myristische CoA. Dann kondensiert das dritte Modul eine L-Tyr-Aminosäure, die dann in D-Tyr isomerisiert wird. Schließlich bindet das vierte Modul eine L-Dab (Diaminobuttersäure) Aminosäure zu dem acyatierten Tripeptid L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL ist somit für die Synthese der drei ersten Aminosäuren des Pyoverdinvorläufers verantwortlich. Die Interaktion von PvdA-Protein mit PvdL ist überraschend, da PvdL im Gegensatz zu PvdI und PvdJ kein modulspezifisches Modul für das L-N5-Formyl-N5-Hydroxyornithin enthält. Diese Wechselwirkung legt nahe, dass alle Enzyme, die für die Pyoverdin-Vorläufer-Biosynthese verantwortlich sind, in großen transienten und dynamischen multienzymatischen Komplexen angeordnet sind19,20.
In diesem Bericht erklären wir ausführlich, wie man die Bakterienstämme konstruieren kann, die nativ die beiden interagierenden eGFP- und mCherry-markierten Proteine exzieren. Wir beschreiben auch die Probenvorbereitung und die Bedingungen für eine effiziente FLIM-FRET-Zellbildgebung. Schließlich schlagen wir ein Schritt-für-Schritt-Tutorial für die Bildanalyse vor, einschließlich eines kürzlich entwickelten Tools, das erweiterte Visualisierungsmöglichkeiten für die einfache Interpretation komplexer FLIM-FRET-Daten bietet. Mit diesem Bericht möchten wir nicht nur abenteuerlustige, sondern auch die meisten Biologen davon überzeugen, dass FRET-FLIM eine zugängliche und leistungsfähige Technik ist, die in der Lage ist, ihre Fragen zu PPI direkt in der nativen zellulären Umgebung zu beantworten.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET bietet einige wichtige Vorteile gegenüber der intensitätsbasierten FRET-Bildgebung. Die Fluoreszenzlebensdauer ist ein intrinsischer Parameter des Fluorophors. Infolgedessen ist sie weder von lokalen Fluorophorkonzentrationen noch von der Intensität der Lichterregung abhängig. Die Fluoreszenzlebensdauer wird zusätzlich auch durch Photobleichungen schlecht beeinflusst. Besonders interessant ist der Nachweis von PPI in Zellen, in denen die Konzentrationen lokaler Proteine in den subzellulären Kompartimenten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen Dr. Ludovic Richert für seine wertvolle Unterstützung bei der FLIM-Datenerfassung und bei der technischen Wartung und Entwicklung des FLIM-Setups. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/) finanziert. VN wird von der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-SPF201809006906) gefördert. YM dankt dem Institut Universitaire de France (IUL) für die Unterstützung und zusätzliche Zeit, um sich der Forschung zu widmen. IJS und JG würdigen das Institut für Arzneimittellieferung in Straßburg für seine finanzielle Unterstützung.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
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