生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定
Summary
ここでは、FLIM-FRET測定を用いて、生きた 緑膿菌 中の2つの高度に異なる発現タンパク質間のタンパク質相互作用を特徴付けるプロトコルについて説明する。このプロトコルには、細菌株構造、細菌固定化、イメージングおよびポストイメージングデータ分析ルーチンが含まれます。
Abstract
タンパク質相互作用(PPI)は、細胞内の様々な主要プロセスを制御します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)とフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を組み合わせることで、生細胞におけるPPIに関する正確な情報を提供します。FLIM-FRETは、FLIM画像の各ピクセルにおけるFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することに依存しており、PPIとその空間細胞組織に関する定量的かつ正確な情報を提供します。ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なるコピー番号で発現する2つの相互作用タンパク質の特定のケースで生きた シュードモナス緑膿症 でPPIを監視するために適用したFLIM-FRET測定のための詳細なプロトコルを提案する。このプロトコルは、PPI特性評価に必要なすべてのステップを詳細に記述しています – 細菌変異体構造から、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを使用して、最終分析まで。
Introduction
タンパク質相互作用(PPI)は、細胞1における様々な主要プロセスを制御する。PPIの役割は、タンパク質組成、親和性機能、細胞2内の位置によって異なります。PPIは、異なる技術3を介して調査することができます。例えば、共免疫沈降法は、PPIを同定または確認するための比較的シンプルで堅牢で安価な技術です。しかし、相互作用するタンパク質の発現レベルが低い場合や、相互作用が一過性または特定の環境でのみ関連する場合は、PPIの研究は困難な場合があります。P.緑膿菌におけるピオーバージン経路の異なる酵素の間で起こるPPIを研究するには、一般的な鉄共因子リプレッサーファーの抑制が緩和され、ピオーバージン経路のすべてのタンパク質の発現が細胞4、5、6に発現することを可能にする必要がある。経路のすべてのタンパク質に対するこの一般的な調節は、それらの相互作用を促進することが期待される細胞内のタイムリーな発現をもたらす。この代謝経路のサイズ、性質、発現量およびタンパク質の数の用語の多様性は、再構成された系6における研究を困難にする。したがって、細胞環境におけるPPIの探索は、タンパク質の本来の文脈における生物学的機能をさらに理解するために重要です。
生細胞7でPPIを探索できる蛍光を含む方法はごくわずかです。測定できる異なる蛍光パラメータの中で、蛍光寿命(すなわち、蛍光色素が光子を放出する前に励起状態にとどまる平均時間)は、生きている細胞で探索する最も興味深いパラメータの1つである可能性が高い。蛍光の寿命は、その環境に非常に敏感であり、FLIMは、蛍光動物の環境に関する化学的または物理的な情報を提供することができます8.これには、蛍光「ドナー」の短い距離に位置する蛍光の「アクセプタ」の存在下で起こり得るフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)の存在が含まれる。エネルギー移動は、ドナー蛍光寿命の有意な短縮(図1A)を生細胞でタンパク質相互作用を直接探索するための強力なアプローチである蛍光生涯イメージング顕微鏡(FLIM)を作る。FLIM は、セル7、8での対話の場所に関する空間情報を提供することもできます。このアプローチは、2 つの相互作用するパートナーの蛍光標識を使用する可能性がある状況で PPI を調査する場合に非常に強力です。
FRET が発生するには – 2 つのフルオロフォア間の距離の重大な条件が必要です8,9.2つの蛍光色素は、10nm以上離れてはなりません。したがって、蛍光のドナーとアクセクサが相互作用複合体内で互いに近接位置することを確実にするために、FLIM-FRET実験を設計する際には注意が必要です。これは制約に見えるかもしれませんが、FRETの距離依存性により、FRETを受けている2つの標識タンパク質が物理的に相互作用しなければならないのは確かに本当の利点です(図1A)。したがって、共局在化実験でPPIに関する明確な回答を得ることの難しい(2つの共局化タンパク質は必ずしも相互作用しない)、FLIM-FRETを使用して問題とはなりません。
図1:FLIM-フレット解析原理FLIM-FRET多次元画像の各ピクセルには、この特定の場所で記録された蛍光減衰に関する情報が含まれています(#counts = チャネルtで検出された光子の数)。(A) FLIM イメージの古典的な表現は、通常、偽色の有効期間エンコードされた 2D イメージ (左) です。色調の変化によって見られるドナーの平均蛍光寿命の減少は、FRETの存在下で観察することができ、この空間領域におけるPPIの存在について有益である。(B)FRETが発生するためにはドナー発光スペクトルとアクソクザの吸収スペクトルとの重複が必要である。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
FRETの第2の要件は、ドナーの発光スペクトルとアクセクサの吸収スペクトルが8(図1B)と重なるべきことである。ドナーの蛍光励起は、アクセクサの直接蛍光励起にほとんど寄与しない波長にあるべきである。フルオロフォアのすべての組み合わせが可能であるとは限らず、FLIM-FRET解釈を容易にするために単一指数蛍光崩壊を有するドナーを優先的に使用することを推奨する。蛍光タンパク質のいくつかのカップルは、人気のeGFP-mCherryカップル11を含むこれらの要件を満たしています(利用可能な蛍光タンパク質FRETペアのパレット上のレビューについては、12,13を参照してください)。
FLIM-FRETは、FLIM画像のすべてのピクセルでFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することを可能にする(図1A)。取得と分析において異なる蛍光寿命を決定する2つの主要な技術があります:周波数領域(FD)14と時間領域(TD)。.TD FLIMはより広く普及し、格子方式15、ストリークカメラ16、または時間相関単一光子計数(TCSPC)技術8を含む異なる可能な検出構成と組み合わせたパルス照明を使用して行われる。FDとTDの両方の技術では、蛍光寿命は直接測定されませんが、測定されたデータの分析を必要とし、寿命または相互作用の存在を推定する必要があります。TCSPC 手法では、最も広く使用されている分析は、残差の加重合計を最小化する最小二乗反復反復関数を使用して、単一または多重指数関数で減衰を適合させることに依存します。
最後に、FLIM-FRETは単一の光子または多光子の励起を使用して両方を行うことができる。最新の焦点面から自己蛍光および光損傷を減らすのようないくつかの利点がある。多光子励起は、厚い3Dサンプル8で作業する場合、より長い励起深さを可能にします。逆に、蛍光タンパク質の二光子吸収断面が17に制限されるため、単一光子励起は通常より効率的である。
ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なる数のコピーで発現する2つの相互作用タンパク質(PvdAおよびPvdL)の特定の場合における生きたP.緑素症におけるPPIのFLIM-FRET測定のためのプロトコルを提案する。PvdAおよびPvdLタンパク質は、ピオーバージン生合成に関与しています。PvdAはL-オルニチンN5-オキシゲナーゼであり、ヒドロキシル化(PvdA)およびホルミネーション(PvdF)18によってL-オルニチンからL-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンを合成する。PvdLは、4つのモジュールから構成される非リボソームペプチド合成(NRPS)酵素です。最初のモジュールは、ミリスティック酸のアシル化を触媒します。第2のモジュールは、L-Gluの活性化とミリスティックcoAへの凝縮を触媒します。そして、第3のモジュールは、D-Tyrで異性体化されるL-Tyrアミノ酸を凝縮する。最後に、第4のモジュールは、L-Dab(ジアミノ酪酸)アミノ酸を結合して、アシル化トリペプチドL-Glu/D-Tyr/L-Dab6を形成する。PvdLは、ピオーバージン前駆体の3つの最初のアミノ酸の合成を担う。PvdLとPvdLとのPvdAタンパク質の相互作用は、PvdIおよびPvdJとは逆に、L-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンに特異的なモジュールを持たないとして驚くべきものです。この相互作用は、ピオーバージン前駆体生合成を担う全ての酵素が、大きな一過性および動的多酵素複合体19,20に配置されることを示唆している。
本報告では、eGFPとmCherry標識タンパク質の2つをネイティブに発現する細菌株を構築する方法を詳細に説明する。また、効率的なFLIM-FRET細胞イメージングのためのサンプル調製および条件についても説明する。最後に、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを含む画像解析のためのステップバイステップチュートリアルを提案する。このレポートでは、冒険的なだけでなく、ほとんどの生物学者に、FRET-FLIMはネイティブセルラー環境でPPIに関する質問に直接対処できるアクセス可能で強力な技術であることを納得させたいと思います。
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET は、強度ベースの FRET イメージングに対していくつかの重要な利点を提供します。蛍光寿命は、蛍光の本質的なパラメータである。その結果、光励起の強度に依存しない蛍光色素の局所濃度に依存しない。蛍光寿命はまた、光漂白によっても影響を受けにくい。特に、局所タンパク質濃度が細胞内の区画または領域全体で非常に不均質である可能性がある細胞内のPPIを証明することは…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、FLIMデータ収集及びFLIMセットアップの技術的なメンテナンスと開発に関する彼の貴重な支援のためにルドヴィック・リヒャレット博士を認める。この作品は、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・アン・チミー(https://icfrc.fr/)からの助成金によって資金提供されました。VNは、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・メディカル(FRM-SPF201809006906)によって資金提供されています。YMは、フランス大学(IUF)の支援と研究に専念する追加の時間を提供してくれたことに感謝しています。IJSとJGは、ストラスブールの薬物送達研究所の財政支援を認めています。
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T. The biosynthesis of pyoverdines. Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -. C., Masse, M. -. J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. FLIM-FRET for Cancer Applications. Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated ‘siderosome’. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W. The bh TCSPC Handbook. Scanning. , 1 (2010).
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing – deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings – International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
