살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.
Summary
우리는 FLIM-FRET 측정을 사용하여 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 두 개의 고도로 다르게 표현된 단백질 사이 단백질 단백질 상호 작용을 특징짓는 프로토콜을 여기에서 기술합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 구조, 박테리아 고정, 이미징 및 이미징 후 데이터 분석 루틴이 포함됩니다.
Abstract
단백질 단백질 상호 작용 (PPI)은 세포에서 다양한 주요 과정을 제어합니다. Förster 공명 에너지 전송 (FRET)와 결합된 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 살아있는 세포에 있는 PPI에 관하여 정확한 정보를 제공합니다. FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 각 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정하여 PPI 및 공간 세포 조직에 대한 정량적이고 정확한 정보를 제공합니다. 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질그리고 견고성을 보여주기 위하여 매우 다른 복사 숫자로 표현된 두 개의 상호 작용 단백질의 특정 경우에 살아있는 슈도모나스 aeruginosa에서 PPI를 감시하기 위하여 신청한 FLIM-FRET 측정을 위한 상세한 프로토콜을 여기에서 제안합니다. 이 프로토콜은 박테리아 돌연변이 구조에서 최종 분석까지 복잡한 FLIM-FRET 데이터의 간단한 해석을 위한 고급 시각화 가능성을 제공하는 PPI 특성화에 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
Introduction
단백질 단백질 상호 작용(PPI)은 세포1에서다양한 주요 공정을 제어한다. PPI의 역할은 단백질 조성, 친화성 기능 및 세포2의위치에 따라 다릅니다. PPI는 다른 기술을 통해 조사 할 수 있습니다3. 예를 들어, 공동 면역 강수량은 PPI를 식별하거나 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 비교적 간단하고 견고하며 저렴한 기술입니다. 그러나 상호 작용하는 단백질이 발현 수준이 낮거나 상호 작용이 특정 환경에서만 일시적이거나 관련이있을 때 PPI를 공부하는 것은 어려울 수 있습니다. P. aeruginosa에서 피버딘 통로의 상이한 효소 사이에서 발생하는 PPI를 연구하는 것은 일반 철 공동 요인 억압자의 억압이 세포4,5,6에서발현될 피버딘 통로의 모든 단백질의 발현을 허용하도록 안심할 것을 요구한다. 통로의 모든 단백질에 대한 이 일반적인 규정은 그들의 상호 작용을 승진시키기 위하여 예상되는 세포에 있는 적시 발현 결과. 크기, 자연, 발현 수준 및 이 대사 경로의 단백질 수의 기간에 있는 다양성은 재구성된 시스템에 있는 연구를 위해 어렵게 만듭니다6. 따라서 그들의 세포 환경에서 PPI를 탐구하는 것은 그들의 네이티브 맥락에서 단백질의 생물학 기능을 더 이해하기 위하여 중요합니다.
형광을 포함하는 몇몇 방법만 살아있는 세포7에서PPI를 탐구하는 것을 허용합니다. 측정할 수 있는 상이한 형광 파라미터 들 사이에서, 형광 수명(즉, 광자를 방출하기 전에 형광이 흥분한 상태로 남아 있는 평균 시간)은 살아있는 세포에서 탐구하는 가장 흥미로운 매개 변수 중 하나일 가능성이 높습니다. 형광의 형광 수명은 환경에 매우 민감하며 FLIM은 따라서 형광주변 주변의 화학적 또는 물리적 정보를 제공할 수있다 8. 여기에는 형광 “기증자”의 짧은 거리에 위치한 형광의 “수용자”가 있는 상황에서 발생할 수 있는 Förster 공명 에너지 전송(FRET)의 존재가 포함됩니다. 에너지 전달은 기증자 형광 수명(그림1A)의현저한 단축을 초래하며, 형광 평생 이미징 현미경 검사법(FLIM)을 살아있는 세포에서 직접 단백질 단백질 상호 작용을 탐구하는 강력한 접근법으로 만듭니다. FLIM은 또한 세포7,8에서상호 작용이 일어나는 위치에 대한 공간 정보를 제공할 수 있다. 이 방법은 상호 작용하는 두 파트너의 형광과 라벨링이 가능한 상황에서 PPI를 조사하는 데 매우 강력합니다.
FRET가 발생하기 위해서는 – 두 형광사이의 거리에 중요한 조건이8,9가필요합니다. 두 형광은 10 nm 이상서로 멀리해서는 안됩니다. 따라서 FLIM-FRET 실험을 설계할 때 주의를 기울여야 하며, 이는 응모의 기증자와 용인이 상호 작용하는 복합체에서 서로 가까이 위치할 수 있는 기회를 갖도록 해야 합니다. 이것은 제약으로 보일 수 있지만, FRET의 거리 의존성은 FRET를 겪고있는 두 개의 라벨 단백질이 물리적으로 상호 작용해야한다는 것을 보장하기 때문에 실제로 진정한 이점입니다(그림 1A). 공동 지역화 실험에서 PPI에 대한 명확한 답변을 얻는 데 어려움 (두 개의 공동 지역화 된 단백질이 반드시 상호 작용하지 않을 수 있음) 따라서 FLIM-FRET를 사용하는 문제가 되지 않습니다.
그림 1: FLIM-FRET 분석 원리. FLIM-FRET 다차원 이미지의 각 픽셀에는 이 특정 위치에 기록된 형광 붕괴에 대한 정보가 포함되어 있습니다(#counts 채널 t에서 감지된 광자 수). (A)FLIM 이미지의 고전적인 표현은 일반적으로 2D 이미지(왼쪽)를 인코딩한 거짓 색상 수명입니다. 기증자의 평균 형광 수명 감소 – 색상 배율의 변화에 의해 볼 수 있듯이 – FRET의 존재에서 관찰 될 수 있으며이 공간 영역에서 PPI의 존재에 대해 유익하다. (B)FRET가 발생하기 위해서는 기증자 배출 스펙트럼과 수용자 흡수 스펙트럼 사이의 중첩이 필요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
FRET에 대한 두 번째 요구 사항은 기증자의 방출 스펙트럼과 수용자의 흡수 스펙트럼이8 (도 1B)과겹쳐야한다는 것입니다. 기증자의 형광 여기는 수락자의 직접적인 형광 여기에 거의 기여하는 파장에 있어야합니다. 형광의 모든 조합이 가능하지 않으며 우리는 또한 FLIM-FRET 해석을 용이하게하기 위해 단일 exponential 형광 부패와 기증자를 우선적으로 사용하는 것이 좋습니다10. 형광 단백질의 몇몇 부부는 대중적인 eGFP-mCherry 부부 를 포함하여 이 요구 사항을 충족합니다(사용 가능한 형광 단백질 FRET 쌍의 팔레트에 대한 검토를 위해12,13참조).
FLIM-FRET는 FLIM 이미지의 모든 픽셀에서 FRET 기증자의 형광 수명 붕괴를 측정할 수있습니다(도 1A). 획득 및 분석에서 서로 다른 형광 수명을 결정하는 두 가지 주요 기술이 있습니다: 주파수 도메인(FD)14 및 시간 도메인(TD). TD FLIM은 보다 광범위하며 게이팅방법(15),줄무늬카메라(16) 또는 시간 상관 단일 광자 계수(TCSPC) 기술8을포함한 다양한 검출 구성과 결합된 펄스 조명을 사용하여 수행됩니다. FD 및 TD 기술 모두 형광 수명은 직접 측정되지 않지만 측정된 데이터를 분석하여 수명 또는 상호 작용의 존재를 추정해야 합니다. TCSPC 기술의 경우 가장 널리 사용되는 분석은 잔류물의 가중 합계를 최소화하는 최소 정사각형 반복 재응경을 사용하여 단일 또는 다중 지수 함수로 붕괴를 피팅하는 데 의존합니다.
마지막으로, FLIM-FRET는 단일 광자 또는 다광자 여기를 사용하여 모두 수행 할 수 있습니다. 최신 초점 평면에서 자동 형광 및 광 피해를 감소 와 같은 몇 가지 장점이 있습니다. 다광원 여기는 또한 두꺼운 3D 샘플8에서작동하는 경우 더 긴 여기 깊이를 허용한다. 반대로, 단일 광자 여기는 형광 단백질의 2광자 흡수 단면이 제한되기 때문에 일반적으로 더 효율적입니다17.
여기서, 우리는 PPI의 중요한 특징을 드러내는 기술의 질과 견고성을 보여주기 위하여 사본의 높게 다른 수로 표현된 2개의 상호 작용 단백질 (PvdA 및 PvdL)의 특정 경우에 살아있는 P. aeruginosa에 있는 PpI의 FLIM-FRET 측정을 위한 프로토콜을 제안합니다. PvdA 및 PvdL 단백질은 피오버딘 생합성에 관여합니다. PvdA는 L-ornithine N5-oxygenase이며 L-N5-formyl-N5-하이드록소니틴을 L-ornithine에서 합성하여 하이드록실화(PvdA) 및 포름(PvdF)18을합성한다. PvdL은 4개의 모듈로 구성된 비리보소말 펩티드 합성(NRPS) 효소이다. 첫 번째 모듈은 미리스틱 산의 아킬레이션을 촉매합니다. 두 번째 모듈은 L-Glu의 활성화와 그 응축을 myristic-coA로 촉매합니다. 그런 다음, 세 번째 모듈은 D-Tyr에서 isomerizedL-Tyr 아미노산을 응축시합니다. 마지막으로, 네 번째 모듈은 L-Dab(Diaminobutyric acid) 아미노산을 결합하여 액면트리페티드 L-Glu/D-Tyr/L-Dab6을형성한다. 따라서 PvdL은 피버딘 전구체의 3가지 제1 아미노산의 합성을 담당한다. PvdL과 PvdA 단백질의 상호 작용은 PvdI 및 PvdJ와 반대로, L-N5-포르몰닐-N5-하이드록소니틴에 특화된 모듈을 운반하지 않는 PvdL로서 놀랍습니다. 이러한 상호작용은 피버딘 전구체 생합성을 담당하는 모든 효소가 큰 과도 및 동적 다중 효소복합체(19,20)로배열된다는 것을 시사한다.
이 보고서에서 우리는 기본적으로 두 상호 작용 eGFP와 mCherry 라벨 단백질을 표현하는 세균균을 구성하는 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 또한 효율적인 FLIM-FRET 세포 화상 진찰을 위한 견본 준비 그리고 조건을 기술합니다. 마지막으로, 최근 개발된 도구를 포함하여 이미지 분석을 위한 단계별 자습서를 제안하여 복잡한 FLIM-FRET 데이터를 간단하게 해석할 수 있는 고급 시각화 가능성을 제공합니다. 이 보고서를 통해, 우리는 모험뿐만 아니라 대부분의 생물학자들에게 FRET-FLIM이 네이티브 셀룰러 환경에서 PPI에 대한 질문을 직접 해결할 수있는 접근 가능하고 강력한 기술이라고 확신하고 싶습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
FLIM-FRET는 강도 기반 FRET 이미징에 비해 몇 가지 주요 이점을 제공합니다. 형광 수명은 형광의 본질적인 매개 변수입니다. 결과적으로, 그것은 빛 여기의 강도에 어느 쪽도 형광의 로컬 농도에 의존 하지 않습니다. 형광 수명은 또한 사진 표백에 의해 또한 제대로 영향을 받지 않습니다. 국소 단백질 농도가 세포 극구 구획 또는 지구 전체에 걸쳐 매우 이질적일 수 있는 세포에서 PPI를 입증하는 것은…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 FLIM 데이터 수집및 FLIM 설정의 기술 유지 보수 및 개발에 대한 그의 귀중한 지원에 대한 박사 루도빅 리커트를 인정합니다. 이 작품은 퐁도 라 레체르체 앙 치미 (https://icfrc.fr/)의 보조금에 의해 지원되었다. VN은 퐁디션 부어 라 레체르체 메디칼 (FRM-SPF201809006906)에 의해 투자된다. YM은 프랑스 인스티투트 대학(IUF)에 감사하며 연구에 전념할 추가 시간을 제공합니다. IJS와 JG는 스트라스부르의 약물 전달 연구소가 재정적 지원을 인정합니다.
Materials
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
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