使用单纳米粒子暗场显微镜可视化细胞膜上金纳米棒的扩散动力学
Summary
在这里，我们展示了使用传统的暗场显微镜来监测金纳米棒（AuNR）在细胞膜上的动态。使用 ImageJ 和 MATLAB 检测单个 AuNR 的位置和方向，AuNR 的扩散状态以单个粒子跟踪分析为特征。
Abstract
分析纳米粒子在细胞膜上的扩散动力学，对于更好地了解细胞吸收过程具有重要作用，为纳米药物输送的合理设计提供了理论依据。单粒子跟踪（SPT）分析可以探测单个纳米粒子在细胞膜上的位置和方向，并揭示其转化和旋转状态。在这里，我们展示了如何使用传统的暗场显微镜来监测活细胞膜上的金纳米棒（AuNR）的动态。我们还展示了如何使用 ImageJ 和 MATLAB 提取 AuNR 的位置和方向，以及如何描述 AuNR 的扩散状态。对数百个粒子的统计分析表明，单个AuNR在U87MG细胞膜表面执行布朗运动。然而，单个长轨迹分析表明，AuNR在膜上有两种截然不同的运动状态，即远程传输和有限区域禁闭。我们的SPT方法可用于研究不同生物细胞的表面或细胞内粒子扩散，并可以成为研究复杂细胞机制的有力工具。
Introduction
纳米粒子（NPs）在膜上的动力学与细胞吸收过程密切相关，这对了解细胞功能、病毒或细菌感染以及人工纳米医学输送系统的发展至关重要。单粒子跟踪 （SPT） 技术是描述 NP3、4的异质行为的可靠工具。一般来说，细胞膜是流动的，这意味着蛋白质和脂质等成分可以在等离子膜平面5、6、7中横向移动。膜组织和结构的空间复杂性可能导致NP和膜之间相互作用的空间异质性。因此，在膜上直接可视化 NP 的运动需要高空间和时间分辨率。
单粒子跟踪显微镜监测活细胞中单个粒子的定位，空间分辨率为几十纳米，时间分辨率为几毫秒，已得到很好的开发，以研究NP或膜分子的动力学8，9。荧光显微成像技术已成为观测活细胞环境中的NPs/分子的宝贵工具。例如，总内部反射荧光显微镜，在具有高空间分辨率的基板/溶液接口上对样品的薄层（约100nm）进行成像，已广泛应用于膜分子动力学13、14的研究。然而，单荧光素的固有缺点，如低强度和快速不可逆的光出血降低了跟踪13的准确性和持续时间。因此，取代荧光探头的非荧光质子NP由于其独特的光学特性，在长期成像研究中越来越受到重视。基于质粒NP探针的散射信号，利用多种光学显微成像技术研究生物过程的机理，如暗场显微镜（DFM）16、干涉学散射（iSCAT）显微镜17和微分干扰对比显微镜（DICM）18。此外，AuNR的运动和旋转动态可以使用DFM和DICM 18、19、20、21、22获得。通常，在SPT实验中，物体的运动由光学显微镜记录，然后通过SPT分析方法3进行分析。单个NP产生的定时轨迹和定向角度通常是随机的和异质的，因此有必要用各种分析方法呈现丰富的动态信息。
在这里，我们提供了一个集成协议，使用DFM监控细胞膜上的AuNR的动态，用ImageJ和MATLAB提取AuNR的位置和方向，并用SPT分析方法描述AuNR的扩散。作为演示，我们在这里展示如何使用SPT协议在U87MG细胞膜上可视化未改性AuNR（CTAB-AuNR，由溴化铵分子作为保护剂合成）的动态。研究表明，CTAB-AuNR可以在生物环境中吸收蛋白质，在细胞膜上移动，然后进入细胞2，20，22。U87MG细胞是中枢神经系统最常见、最恶性的肿瘤，其膜受体表达异常。膜受体可以与AuNR上的蛋白质相互作用，影响AuNR的动态。我们的协议通常适用于生物学领域的其他SPT实验。
Protocol
Representative Results
Discussion
所展示的协议用于研究细胞膜上的AuNR的动态。该协议由四个部分组成，包括微观成像、数据提取、动态参数计算和数据分析方法，每个部分都是灵活和通用的。因此，未来有许多可能的应用，例如，研究膜上NP相关膜分子的运动、NP标记受体的内分泌动力学、细胞内NP和囊泡涂层的NPs沿着微管运输的动态分析等。
基本步骤是使用DFM来映像细胞膜上的AuNR运动。目前，已开发出多…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会的支持，赠款编号为21425519、91853105和21621003。
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
References
- Rees, P., Wills, J. W., Brown, M. R., Barnes, C. M., Summers, H. D. The origin of heterogeneous nanoparticle uptake by cells. Nature Communication. 10 (1), 2341 (2019).
- Behzadi, S., et al. Cellular uptake of nanoparticles: journey inside the cell. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4218-4244 (2017).
- Shen, H., et al. Single Particle Tracking: From Theory to Biophysical Applications. Chemical Reviews. 117 (11), 7331-7376 (2017).
- Saxton, M. J. Single-particle tracking: connecting the dots. Nature Methods. 5 (8), 671-672 (2008).
- Kusumi, A., et al. Dynamic organizing principles of the plasma membrane that regulate signal transduction: commemorating the fortieth anniversary of Singer and Nicolson’s fluid-mosaic model. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 215-250 (2012).
- Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The Lateral Organization and Mobility of Plasma Membrane Components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
- Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Rosenberg, J., Huang, J. Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (155), e59914 (2020).
- Kusumi, A., Tsunoyama, T. A., Hirosawa, K. M., Kasai, R. S., Fujiwara, T. K. Tracking single molecules at work in living cells. Nature Chemical Biology. 10 (7), 524-532 (2014).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments. (151), e59387 (2019).
- Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing protein-DNA interactions in live bacterial cells using photoactivated single-molecule tracking. Journal of Visualized Experiments. (85), e511177 (2014).
- Pinaud, F., Clarke, S., Sittner, A., Dahan, M. Probing cellular events, one quantum dot at a time. Nature Methods. 7 (4), 275-285 (2010).
- Mehidi, A., et al. Transient Activations of Rac1 at the Lamellipodium Tip Trigger Membrane Protrusion. Current Biology. 29 (17), 2852-2866 (2019).
- Ye, Z., Wang, X., Xiao, L. Single-Particle Tracking with Scattering-Based Optical Microscopy. Analytical Chemistry. 91 (24), 15327-15334 (2019).
- Pan, Q., Zhao, H., Lin, X., He, Y. Spatiotemporal Heterogeneity of Reactions in Solution Observed with High-Speed Single-Nanorod Rotational Sensing. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 58 (25), 8389-8393 (2019).
- Taylor, R. W., et al. Interferometric scattering microscopy reveals microsecond nanoscopic protein motion on a live cell membrane. Nature Photonics. 13 (7), 480-487 (2019).
- Chen, K., et al. Characteristic rotational behaviors of rod-shaped cargo revealed by automated five-dimensional single particle tracking. Nature Communication. 8 (1), 887 (2017).
- Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Y. Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces. Angewandte Chemie. International Ed. in English. 53 (27), 6951-6955 (2014).
- Lehui, X., Yan, H., Edward, S. Y. Three Dimensional Orientational Imaging of Nanoparticles with Darkfield Microscopy. Analytical Chemistry. 82, 5268-5274 (2010).
- Ge, F., Xue, J., Wang, Z., Xiong, B., He, Y. Real-time observation of dynamic heterogeneity of gold nanorods on plasma membrane with darkfield microscopy. Science China Chemistry. 62, 1072-1081 (2019).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Janczura, J., Weron, A. Ergodicity testing for anomalous diffusion: small sample statistics. The Journal of Chemical Physics. 142 (14), 144103 (2015).
- Kim, D. H., et al. Single particle tracking-based reaction progress kinetic analysis reveals a series of molecular mechanisms of cetuximab-induced EGFR processes in a single living cell. Chemical Science. 8 (7), 4823-4832 (2017).
- Kurzthaler, C., et al. Probing the Spatiotemporal Dynamics of Catalytic Janus Particles with Single-Particle Tracking and Differential Dynamic Microscopy. Physical Review Letters. 121 (7), 078001 (2018).
- Lin, X., Pan, Q., He, Y. In situ detection of protein corona on single particle by rotational diffusivity. Nanoscale. 11 (39), 18367-18374 (2019).
- Wei, L., et al. Sub-diffraction-limit localization imaging of a plasmonic nanoparticle pair with wavelength-resolved dark-field microscopy. Nanoscale. 9 (25), 8747-8755 (2017).
- Cheng, X., Dai, D., Xu, D., He, Y., Yeung, E. S. Subdiffraction-limited plasmonic imaging with anisotropic metal nanoparticles. Analytical Chemistry. 86 (5), 2303-2307 (2014).
- Belyy, V., et al. PhotoGate microscopy to track single molecules in crowded environments. Nature Communication. 8, 13978 (2017).
