Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única
Summary
Aqui, mostramos o uso da microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular. A localização e orientação de AuNRs únicos são detectadas usando ImageJ e MATLAB, e os estados difusivos de AuNRs são caracterizados por uma análise de rastreamento de partículas únicas.
Abstract
Analisar a dinâmica difusiva das nanopartículas na membrana celular desempenha um papel significativo na melhor compreensão do processo de absorção celular e fornece uma base teórica para o desenho racional da entrega de nanoma medicamentos. A análise de rastreamento de partículas únicas (SPT) poderia sondar a posição e orientação de nanopartículas individuais na membrana celular, e revelar seus estados translacionais e rotacionais. Aqui, mostramos como usar a microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular viva. Também mostramos como extrair a localização e orientação dos AuNRs utilizando ImageJ e MATLAB, e como caracterizar os estados difusivos de AuNRs. A análise estatística de centenas de partículas mostra que um único AuNRs realiza movimento browniano na superfície da membrana celular U87 MG. No entanto, a análise individual de longa trajetória mostra que os AuNRs têm dois tipos distintamente diferentes de estados de movimento na membrana, ou seja, transporte de longo alcance e confinamento de áreas limitadas. Nossos métodos SPT podem ser potencialmente usados para estudar a difusão de partículas superficiais ou intracelulares em diferentes células biológicas e podem se tornar uma ferramenta poderosa para investigações de mecanismos celulares complexos.
Introduction
A dinâmica das nanopartículas (NPs) na membrana está intimamente associada ao processo de captação celular, essencial para a compreensão das funções celulares, infecções virais ou bacterianas e o desenvolvimento de sistemas de entrega nanomédicas artificiais1,2. A técnica de rastreamento de partículas únicas (SPT) é uma ferramenta robusta para caracterizar os comportamentos heterogêneos das NPs3,4. Em geral, a membrana celular é fluidica, o que significa que os componentes como proteínas e lipídios podem se mover lateralmente no plano da membrana plasmática5,6,7. A complexidade espiotemporal da organização e estrutura da membrana pode levar à heterogeneidade espiotemporal da interação entre NPs e membrana. Assim, a visualização direta do movimento de NPs na membrana requer alta resolução espacial e temporal.
Microscopia de rastreamento de partículas únicas que monitora a localização de partículas individuais em células vivas com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros e uma resolução temporal de milissegundos foi bem desenvolvida para estudar as NPs ou moléculas de membrana dinâmica8,9. Técnicas de imagem microscópica baseadas em fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar NPs/moléculas no ambiente celular vivo9,10,11,12. Por exemplo, a microscopia total de fluorescência de reflexão interna, que imagens de camadas finas (~100 nm) da amostra na interface substrato/solução com alta resolução espátula tem sido amplamente utilizada em estudos da dinâmica das moléculas de membrana13,14. No entanto, as desvantagens inerentes aos fluoroforos únicos, como baixa intensidade e fotobleaching irreversível rápido reduzem a precisão e a duração do rastreamento13. Portanto, NPs plasmônicos não fluorescentes, que substituem as sondas fluorescentes, têm atraído cada vez mais atenção em estudos de imagem de longo prazo devido às suas características ópticas únicas15. Com base nos sinais de dispersão de sondas NP plasmônicas, vários tipos de tecnologias ópticas de imagem microscópica têm sido utilizadas para estudar o mecanismo de processos biológicos, como microscopia de campo escuro (DFM)16,microscopia de dispersão interferométrica (iSCAT)17 e microscopia de contraste de interferência diferencial (DICM)18. Além disso, a dinâmica de movimento e rotação de AuNRs pode ser obtida utilizando DFM e DICM18,19,20,21,22. Normalmente, em um experimento SPT, o movimento do objeto é registrado pelo microscópio óptico e, em seguida, analisado pelos métodos de análise SPT3. As trajetórias e ângulos orientacionais gerados por NPs individuais são normalmente estocásticos e heterogêneos, por isso é necessário apresentar informações dinâmicas abundantes com vários métodos de análise.
Aqui, fornecemos um protocolo integrado que monitora a dinâmica dos AuNRs na membrana celular utilizando DFM, extrai a localização e orientação dos AuNRs com ImageJ e MATLAB e caracteriza a difusão de AuNRs com métodos de análise SPT. Como demonstração, mostramos aqui como usar o protocolo SPT para visualizar dinâmicas de AuNRs não modificados (CTAB-AuNRs, sintetizados pela molécula de brometo de amônio cetililomina como agente protetor) na membrana celular U87 MG. Foi demonstrado que os CTAB-AuNRs podem adsorb proteínas em ambiente biológico, mover-se na membrana celular e, emseguida,entrar nas células2,20,22. A célula U87 MG é o tumor mais comum e mais maligno do sistema nervoso central, e seus receptores de membrana são anormalmente expressos. Os receptores de membrana podem interagir com proteínas em AuNRs, que influenciam a dinâmica dos AuNRs. Nosso protocolo é geralmente aplicável a outros experimentos SPT no campo da biologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado é utilizado para estudar a dinâmica dos AuNRs na membrana celular. O protocolo consiste em quatro partes, incluindo imagem microscópica, extração de dados, cálculo de parâmetros dinâmicos e métodos de análise de dados, e cada parte é flexível e universal. Portanto, existem muitas aplicações futuras possíveis, por exemplo, estudando o movimento de moléculas de membrana ligadas ao NP na membrana, dinâmicas de endocitose de receptores rotulados por NP, análise dinâmica de NPs intra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China com números de bolsas de 21425519, 91853105 e 21621003.
Materials
| CTAB coated gold nanorods(CTAB-AuNRs) | Nanoseedz | NR-40-650 | 85 nm * 40 nm |
| Color CMOS camera | Olympus | DP74 | Japan |
| Coverslips | Citoglas | z10212222C | 22*22 mm |
| Dark-field microscopy | Nikon | 80i | upright microscope |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099141 | |
| Fiji | National Institutes of Health | 2.0.0-rc-69/1.52 p | a distribution of ImageJ |
| Grooved glass slide | Sail brand | 7103 | Single concave |
| Image J | National Institutes of Health | 1.52 j | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | |
| MATLAB Code | https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020 | ||
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 10-010-CVR | with phenol red |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 51200038 | no phenol red |
| Origin | OriginLab | Origin Pro 2018C | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353002 | |
| Plastic cell culture dishes | Falcon | 353001 | 35*10 mm |
| U87 MG cell | American Type Culture Collection | ATCC HTB-14 | a human primary glioblastoma cell line |
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