CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入
Summary
CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex pipiensのノックアウトラインを生成する方法を記述します。
Abstract
Culex蚊は、西ナイルウイルスやイヌの心臓虫やゾウガシスなどのフィラリア線虫によって引き起こされる病気を含む人間と動物の健康に悪影響を及ぼすいくつかの疾患の主要なベクターです。最近では、CRISPR/Cas9ゲノム編集は、アノフェレス属に属する蚊を含むいくつかの昆虫種の新たに敷設された胚にガイドRNA(gRNA)と複合体化されたCas9タンパク質を注入することによって、部位指向の突然変異を誘導するために使用されている。Culex蚊の操作と注入は、これらの蚊が他の種の蚊のように個別に卵をいかだに置くのではなく、いかだで直立させるので、少し難しいです。ここでは、gRNAを設計し、Cas9タンパク質とそれらを複雑にする方法、卵を産むためにCulexピピエンの雌の蚊を誘導する方法、およびCas9 / gRNAを用いたマイクロインジェクションのために新しく産卵した胚を調製して注入する方法について説明します。また、必要な突然変異のために注入された蚊を飼育およびスクリーニングする方法についても説明する。代表的な結果は、この技術がCulex蚊のゲノムに部位指向突然変異を誘導するために使用され、わずかな改変を伴って、他の蚊種でもヌル突然変異体を生成するために使用できることを示している。
Introduction
Culex蚊は、世界の温帯および熱帯地域全体に分布し、西ナイルウイルス1、セントルイス脳炎2だけでなく、イヌ心虫3および象の毛虫症を引き起こすフィラリア線虫を含むいくつかの致命的なウイルスを伝播する。Cx.クインケファシアトゥス、Cx.ピピエンスピピエンス、Cx.ピピエンス痴漢を含むCulex pipiens複合体のメンバーは、彼らの生物学の多くの側面で顕著なバリエーションを示しています。例えば、Cx.quinquefasciatusおよびCx.ピピエンス痴漢は越冬休眠5、6、Cx.ピピエンスピピエンは堅牢な季節応答を表示し、短い日7、8に応答してジアポーズに入ることができない。さらに、Cx.ピピエンス痴漢はより人類愛的である傾向があり、Cx.ピピエンとCx.キンケファシアトゥスはより動物性の6です。しかし、米国および世界の他の多くの場所で、これらの種は、Cx.ピピエンスピピエンとCx.ピピエンス痴漢のハイブリッドとして病気の伝染に強い影響を与える交雑種は日和見フィーダーであり、鳥と人間の両方を噛み、それによって西ナイルウイルスの橋梁ベクトルとして機能します。Culex蚊の生物学のこれらの側面やその他の魅力的な側面を研究することは、Culex蚊が静止と乾燥耐性卵10を生成するAedes蚊よりも実験室で飼育するのがわずかに難しく、機能的な分子ツールがCulex種のために十分に開発されていないため、部分的に妨げられております。
CRISPR/Cas9ゲノム編集は、南部の家の蚊、カレックスキンケファシアトゥス14、15、16を含むいくつかの重要な蚊種11、12、13の生物学を評価するために使用されている強力な技術です。ジェニファー・ダウドナとエマニュエル・シャルパンティエによって開発されたこの技術は、細菌由来のCRISPR関連エンドヌクレアーゼ(Casタンパク質、ファン・デル・ウーストらによるレビューを参照)によってウイルスに対する自然な細菌防御を利用しています。動物の胚に注入されると、Cas9タンパク質と適切なガイドRNAを組み合わせて、ゲノム内で二本鎖破断を生じさせることができる。これは、エンドヌクレアーゼ活性をゲノムの特定の領域に導くガイドRNAと複合体化されたCas9タンパク質を使用することによって最も頻繁に行われます。Cas9タンパク質が部位特異的な二本鎖破断を作成した後、細胞機械は2つのメカニズムのいずれかを使用して破断を修復しようとします。1つ目は、非相同の端結合(NHEJ)を通じて2つの端を結び付ける必要があり、これはエラーが起こりやすいため、ゲノムにアウトフレーム挿入および欠失を生じさせ、非機能的なタンパク質を引き起こし、ノックアウト突然変異を生じさせる。あるいは、細胞機械は、正しく破断を修復するために類似した配列を見つけることによって相同性指向の修復(HDR)を使用するかもしれません。同様の配列は、生物内の第2染色体によって提供され得る(レビュー18を参照)。しかし、修復された配列が元の配列と正確に一致する場合、Cas9タンパク質は再びDNAを切断することができます。あるいは、標的配列の切断部位の両側に相同配列を含むドナープラスミドを、代替修復配列(蛍光マーカータンパク質、元遺伝子の改変版、またはその他の改変)を含み、ゲノムにコピーして挿入したり、「ノックイン」したりすることもできます。
胚を注入する際にはタイミングが重要であり、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して昆虫の突然変異を作り出す場合は特にそうです。これは、Cas9タンパク質とgRNAは、胚が間合状態にある場合、細胞膜が形成される前、および胚内で複数の核がアクセス可能である場合にのみ突然変異を生成する最大の能力を有するためである。蚊の場合、原子核は、温度19に応じて、卵子から〜2〜4時間後に周囲に到達するため、この時間までにマイクロインジェクションが成功する必要があります。さらに、Cas9タンパク質は、注射に起因する個体が細胞のモザイクを含み、所望の突然変異を有する個体が含まれるなど、アクセス可能な核DNAを切断する。これらの突然変異を正常に継承するためには、Cas9タンパク質は、将来の卵子と精子を生み出す生殖細胞系列に存在するDNAを切断する必要があります。生殖細胞系列に突然変異が発生することを確実にするためには、昆虫生殖細胞系の前駆体である胚内の極細胞の位置に近い全ての物質を注入するのが最善である。極細胞は 、Culex 胚20の後端付近に位置する。胚を注入することに加えて、所望の突然変異を検出するためには、子孫の交育とスクリーニングのための慎重な計画を策定することが不可欠である。
このプロトコルは、gRNAを生成し、注射ミックスを準備するためにCas9タンパク質でそれらを複雑にする方法だけでなく、卵を産むためにCulexピピエンのメスの蚊を誘導する方法とCRISPR / Cas9媒介ゲノム編集のためにそれらの卵を準備し、注入する方法を説明します。さらに、注射された胚の後部、横断、スクリーニングの方法とその子孫を説明し、所望の突然変異が得られたことを確認する。このプロトコルを使用して、私たちは、カレックスピピエンのバックアイ株で、関心のある遺伝子、サイクル、ヌル突然変異を生成しました。この株はもともとオハイオ州コロンバスのフィールド収集蚊から2013年に設立され、Meutiラボによって維持されています。このプロトコルは、Culex蚊および他の蚊種におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集を必要とする追加の研究に使用することができ、より一般的には、任意の昆虫種にCRISPR / Cas9ゲノム編集を採用することに関連しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは 、Culex 蚊のゲノムに特定の突然変異を導入する方法を提示し、他の蚊のゲノムを編集するためにも使用することができます。このプロトコルは、注射材料を準備する方法だけでなく、蚊に卵を産む方法の詳細なビデオ概要、ならびにそれらの卵を準備して注入する方法の詳細なビデオ概要を提供するという点で重要です。また、メスの Cx.ピピエン の生物学を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、デビッド・オブロフタ博士と昆虫遺伝技術調整研究ネットワークのすべてのメンバーに、彼らが遺伝技術の実施に関して私たちや他の人々に提供する助けと訓練に感謝します。我々は特に 、Culex 胚を注入し、孵化できるようにマイクロマニピュレーションプロトコルを最適化してくれたチャンナ・アルヴィヘアに感謝する。また、ムーティラボで働く学部生のデバンテ・シモンズとジョセフ・ウルソは、トランスジェニック蚊の世話とスクリーニングを支援し、ITFのゾラ・エルムカに対して、蚊の注射の飼育と準備を支援してくれたことに感謝します。この研究は、MEMに提供されたOSUの感染症研究所からの学際的種子助成金によって支えられた。
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
