Подготовка и инъекция эмбрионов комаров Culex для генерации нулевых мутаций с использованием CRISPR/Cas9
Summary
CRISPR/Cas9 все чаще используется для характеристики функции генов в немоделизованных организмах. Этот протокол описывает, как генерировать нокаутирующие линии Culex pipiens,от приготовления инъекционных смесей до получения и инъекции эмбрионов комаров, а также как заводить, скрещивать и проверять введенных комаров и их потомство на желаемые мутации.
Abstract
Комары Culex являются основными переносчиками нескольких заболеваний, которые негативно влияют на здоровье человека и животных, включая вирус Западного Нила и заболевания, вызванные филярными нематодами, такими как собачий сердечный червь и слоновост. В последнее время редактирование генома CRISPR / Cas9 было использовано для индуцирования мутаций, направленных на сайт, путем введения белка Cas9, который был комплексован с направляющей РНК (гРНК), в недавно отложенные эмбрионы нескольких видов насекомых, включая комаров, принадлежащих к родам Anopheles и Aedes. Манипулировать комарами Culex и вводить их немного сложнее, так как эти комары откладывают яйца вертикально в плотах, а не индивидуально, как другие виды комаров. Здесь мы описываем, как проектировать гРНК, комплексовать их с белком Cas9, побуждать самок комаров Culex pipiens откладывать яйца, а также как готовить и вводить недавно отложенные эмбрионы для микроинъекции Cas9 / gRNA. Мы также описываем, как выводить и проверять введенных комаров на желаемую мутацию. Репрезентативные результаты показывают, что этот метод может быть использован для индуцирования мутаций, направленных на сайт, в геноме комаров Culex и, с небольшими изменениями, может быть использован для генерации нулевых мутантов у других видов комаров.
Introduction
Комары Culex распространены по всем умеренным и тропическим регионам мира и передают несколько смертельных вирусов, включая вирус Западного Нила1,энцефалит Сент-Луиса2, а также филярные нематоды, которые вызывают собунского сердечного червя3 и слоновость4. Члены комплекса Culex pipiens, который включает Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens и Cx. pipiens molestus,демонстрируют поразительные различия во многих аспектах своей биологии. Например, в то время как Cx. quinquefasciatus и Cx. pipiens molestus не способны войти в зимующее спячку5,6, Cx. pipiens pipiens демонстрируют устойчивые сезонные реакции и входят в диапаузу в ответ на короткиедни 7,8. Кроме того, Cx. pipiens molestus, как правило, более антропофильны, в то время как Cx. pipiens и Cx. quinquefasciatus более зоофильны6. Однако в Соединенных Штатах и во многих других местах мира эти виды скрещиваются, что имеет серьезные последствия для передачи болезни, поскольку гибриды Cx. pipiens pipiens и Cx. pipiens molestus являются оппортунистическими кормушками и будут кусать как птиц, так и людей9,тем самым служа мостиками для вируса Западного Нила. Изучение этих и других увлекательных аспектов биологии комаров Culex было затруднено, отчасти потому, что комаров Culex немного сложнее вырастить в лаборатории, чем комаров Aedes, которые производят устойчивые к покоям и высыханию яйца10, и потому, что функциональные молекулярные инструменты не так хорошо разработаны для видов Culex.
Редактирование генома CRISPR / Cas9 является мощной технологией, которая была использована для оценки биологии нескольких важных видов комаров11, 12,13,включая южного домашнего комара, Culex quinquefasciatus14,15,16. Эта технология, разработанная Дженнифер Дудна и Эммануэль Шарпантье, использует естественную бактериальную защиту от вирусов бактериальными эндонуклеазами, связанными с CRISPR (белки Cas; см. обзор Van der Oost et al.17). При введении в эмбрионы животных белки Cas9 в сочетании с соответствующей направляющей РНК могут производить двухцепочечные разрывы в геноме. Чаще всего это делается с помощью белка Cas9, который комплексуется с направляющими РНК, которые направляют активность эндонуклеазы в определенную область генома. После того, как белок Cas9 создал специфический для сайта двухцепочечный разрыв, клеточный механизм пытается восстановить разрыв, используя один из двух механизмов. Первый влечет за собой лигирование двух концов вместе через негомологичные концевое соединение (NHEJ), которое подвержено ошибкам и часто производит внерамочные вставки и делеции в геноме, которые могут привести к нефункциональным белкам, тем самым генерируя нокаут-мутацию. В качестве альтернативы, клеточный механизм может использовать гомологическое восстановление (HDR), находя аналогичные последовательности для правильного восстановления разрыва. Аналогичная последовательность может быть обеспечена второй хромосомой в организме (см. обзор18). Однако, если восстановленная последовательность точно соответствует исходной последовательности, белок Cas9 сможет снова разрезать ДНК. В качестве альтернативы исследователи могут также включить донорскую плазмиду, которая содержит гомологичные последовательности по обе стороны от места разреза целевой последовательности с альтернативной последовательностью репарации — часто флуоресцентным маркерным белком, модифицированной версией исходного гена или другой модификацией — которая может быть скопирована и вставлена в геном или «выбита».
Время имеет решающее значение при инъекции эмбрионов, и это особенно актуально при использовании редактирования генома CRISPR / Cas9 для создания мутаций у насекомых. Это связано с тем, что белок Cas9 и гРНК обладают наибольшей способностью генерировать мутации только тогда, когда эмбрион находится в синцитиальном состоянии, до образования клеточных мембран и когда в эмбрионе доступны несколько ядер. У комаров ядра достигают периферии ~2-4 часа после яйцекладки, в зависимости от температуры19,и поэтому успешная микроинъекция должна произойти до этого времени. Кроме того, белок Cas9 отрежет любую ядерную ДНК, к которым он может получить доступ, так что человек, полученный в результате инъекции, будет содержать мозаику клеток, некоторые из них имеют желаемую мутацию, а другие нет. Чтобы эти мутации были успешно унаследованы, белок Cas9 должен разрезать ДНК, которая находится в зародышевой линии, которая даст начало будущим яйцеклеткам и сперматозоидам. Чтобы гарантировать, что мутации генерируются в зародышевой линии, лучше всего вводить все материалы, близкие к расположению клеток полюса внутри эмбриона, которые являются прародителями зародышевой линии насекомых. Полюсные клетки расположены вблизи заднего конца эмбрионов Culex 20. Помимо инъекций эмбрионов, крайне важно разработать тщательный план скрещивания и скрининга потомства с целью выявления желаемой мутации.
Этот протокол описывает, как генерировать гРНК и комплексовать их с белком Cas9 для приготовления инъекционных смесей, а также как побудить самок комаров Culex pipiens откладывать яйца и как подготовить и ввести эти яйца для редактирования генома, опосредованного CRISPR / Cas9. Кроме того, мы описываем, как воспитать, скрестить и экранировать введенные эмбрионы и их потомство, чтобы подтвердить, что желаемая мутация была получена. Используя этот протокол, мы генерировали нулевые мутации для интересуемого гена, цикла,в штамме Buckeye Culex pipiens. Этот штамм был первоначально создан в 2013 году из комаров, собранных в полевых условиях в Колумбусе, штат Огайо, и поддерживается лабораторией Meuti. Этот протокол может быть использован для дополнительных исследований, которые требуют редактирования генома CRISPR / Cas9 у комаров Culex, а также других видов комаров, и, в более общем плане, имеет отношение к использованию редактирования генома CRISPR / Cas9 для любых видов насекомых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет методы введения специфических мутаций в геном комаров Culex и может быть использован для редактирования генома других комаров. Протокол важен тем, что он предоставляет конкретные детали не только о том, как подготовить инъекционные материалы, но и подробн…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Дэвида О’Брохту и всех членов Координационной исследовательской сети по генетическим технологиям насекомых за помощь и обучение, которые они предоставляют нам и другим лицам по внедрению генетических технологий. Мы особенно благодарим Чанну Алувихаре за оптимизацию протокола микроманипуляции, позволяющую вводить и вылуплять эмбрионы Culex. Мы также благодарим Деванте Симмонса и Джозефа Урсо, студентов бакалавриата, работающих в лаборатории Meuti, за их помощь в уходе и скрининге трансгенных комаров и Зору Элмками из МФТ за помощь в выращивании и подготовке комаров к инъекциям. Эта работа была поддержана грантом междисциплинарных семян от Института инфекционных заболеваний при ОГУ, предоставленным MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
References
- Hamer, G. L., et al. Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).
- Bailey, C. L., et al. Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes. Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).
- Sabry, M. A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis. The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).
- Cancrini, G., et al. Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy. Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).
- Wilton, D. P., Smith, G. C. Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).
- Mattingly, P. F. The Culex pipiens complex. Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).
- Eldridge, B. F. The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).
- Spielman, A., Wong, J. Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens. Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).
- Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring. Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).
- Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 10 (3), (2015).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Liu, T., et al. Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus. Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).
- Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies. Scientific Reports. 6, 24652 (2016).
- Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).
- Anderson, M. E., et al. CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say. PloS one. 14 (11), (2019).
- Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).
- Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
- Monnerat, A. T., et al. Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae). Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
