Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9
Summary
O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.
Abstract
Os mosquitos Culex são os principais vetores de várias doenças que afetam negativamente a saúde humana e animal, incluindo o vírus do Nilo Ocidental e doenças causadas por nematoides filarial, como verme canino e elefanta. Recentemente, a edição do genoma CRISPR/Cas9 tem sido usada para induzir mutações direcionadas ao local, injetando uma proteína Cas9 que foi complexada com um guia de RNA (gRNA) em embriões recém-colocados de várias espécies de insetos, incluindo mosquitos que pertencem aos gêneros Anopheles e Aedes. Manipular e injetar mosquitos Culex é um pouco mais difícil, pois esses mosquitos colocam seus ovos em ré em jangadas em vez de individualmente como outras espécies de mosquitos. Aqui descrevemos como projetar gRNAs, complá-los com proteína Cas9, induzir mosquitos fêmeas de pipiens Culex para colocar ovos, e como preparar e injetar embriões recém-colocados para microinjeção com Cas9/gRNA. Também descrevemos como criar e testar mosquitos injetados para a mutação desejada. Os resultados representativos demonstram que essa técnica pode ser usada para induzir mutações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos Culex e, com pequenas modificações, pode ser usada para gerar mutantes nulos em outras espécies de mosquitos também.
Introduction
Os mosquitos Culex são distribuídos pelas regiões temperadas e tropicais do mundo e transmitem vários vírus mortais, incluindo o vírus do Nilo Ocidental1, encefalite de St. Louis2, bem como nematoides filares que causam verme canino3 e elefantíase4. Membros do complexo Culex pipiens, que inclui Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus,mostram variações marcantes em muitos aspectos de sua biologia. Por exemplo, enquanto Cx. quinquefasciatus e Cx. pipiens molestus são incapazes de entrar em uma dormência overwintering5,6, Pipiens pipiens exibem respostas sazonais robustas e entram em diapausa em resposta a curtos dias7,8. Além disso, cx. pipiens molestus tendem a ser mais antropofílicos, enquanto Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus são mais zoofílicos6. No entanto, nos Estados Unidos e em muitos outros lugares do mundo, essas espécies se cruzaram, o que tem fortes implicações para a transmissão de doenças como híbridos do Cx. pipiens pipiens e Cx. pipiens molestus são alimentadores oportunistas e vão morder aves e humanos9, servindo assim como vetores de ponte para o vírus do Nilo Ocidental. Estudar esses e outros aspectos fascinantes da biologia dos mosquitos Culex tem sido dificultado, em parte, porque os mosquitos Culex são um pouco mais difíceis de criar em laboratório do que os mosquitos Aedes, que produzem ovos quiescentes e resistentes à dessecação10 e porque ferramentas moleculares funcionais não são tão bem desenvolvidas para espécies Culex.
A edição do genoma CRISPR/Cas9 é uma tecnologia poderosa que tem sido usada para avaliar a biologia de várias espécies importantes de mosquitos11,12,13, incluindo o mosquito da casa sulista, Culex quinquefasciatus14,15,16. Esta tecnologia, desenvolvida por Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, explora uma defesa bacteriana natural contra vírus por endonucleases bacterianamente derivadas, associadas a CRISPR (proteínas Cas; ver revisão por Van der Oost et al.17). Quando injetadas em embriões animais, as proteínas Cas9 em combinação com um guia apropriado RNA podem produzir quebras duplas dentro do genoma. Isso é mais frequentemente feito usando a proteína Cas9 que é complexada com rnas guia, que direciona a atividade endonuclease para uma região específica do genoma. Depois que a proteína Cas9 criou uma ruptura de dois fios específicos do local, o maquinário celular tenta reparar a ruptura usando um dos dois mecanismos. O primeiro implica ligar as duas extremidades juntas através da junção final não homólogo (NHEJ), que é propensa a erros e muitas vezes produz inserções e exclusões fora do quadro no genoma que podem resultar em proteínas não funcionais, gerando assim uma mutação de knock-out. Alternativamente, o maquinário celular pode usar reparação direcionada à escoologia (HDR) encontrando sequências semelhantes para reparar corretamente a ruptura. A sequência semelhante pode ser fornecida pelo segundo cromossomo dentro do organismo (ver revisão18). No entanto, se a sequência reparada corresponde exatamente à sequência original, a proteína Cas9 será capaz de cortar novamente o DNA. Alternativamente, os pesquisadores também podem incluir um plasmídeo doador que contém sequências homólogos em ambos os lados do local de corte da sequência de destino com uma sequência de reparo alternativa — muitas vezes uma proteína de marcador fluorescente, versão modificada do gene original ou outra modificação — que pode ser copiada e inserida no genoma, ou “derrubada”.
O tempo é crítico ao injetar embriões, e este é especialmente o caso ao usar a edição do genoma CRISPR/Cas9 para criar mutações em insetos. Isso ocorre porque a proteína Cas9 e os gRNAs têm a maior capacidade de gerar mutações somente quando o embrião está em seu estado sincicial, antes que as membranas celulares se formem e quando múltiplos núcleos estiverem acessíveis dentro do embrião. Para os mosquitos, os núcleos atingem a periferia ~2-4 horas após o oviposition, dependendo da temperatura19, e, portanto, a microinjeção bem sucedida deve ocorrer antes deste tempo. Além disso, a proteína Cas9 cortará qualquer DNA nuclear que possa acessar, de tal forma que o indivíduo resultante da injeção conterá um mosaico de células, algumas tendo a mutação desejada, e outras não. Para que essas mutações sejam herdadas com sucesso, a proteína Cas9 deve cortar o DNA que reside na linha germinal que dará origem aos futuros óvulos e espermatozoides. Para garantir que as mutações sejam geradas na linha germinal é melhor injetar todos os materiais próximos à localização das células do polo dentro do embrião, que são os progenitores da germinação de insetos. As células do polo estão localizadas perto da extremidade posterior dos embriões Culex 20. Além de injetar embriões, é imprescindível desenvolver um plano cuidadoso de travessia e triagem de descendentes, a fim de detectar a mutação desejada.
Este protocolo descreve como gerar gRNAs e complexá-los com proteína Cas9 para preparar misturas de injeção, bem como como induzir mosquitos fêmeas de pipiens Culex a colocar ovos e como preparar e injetar esses ovos para edição de genoma mediado por CRISPR/Cas9. Além disso, descrevemos como trás, cruz e tela injetados embriões e sua descendência para confirmar que a mutação desejada foi obtida. Usando este protocolo, geramos mutações nulas para um gene de interesse, ciclo, na cepa Buckeye de Culex pipiens. Esta cepa foi originalmente estabelecida em 2013 a partir de mosquitos coletados em campo em Columbus, Ohio e é mantida pelo laboratório Meuti. Este protocolo pode ser usado para estudos adicionais que requerem edição de genomas CRISPR/Cas9 em mosquitos Culex, bem como outras espécies de mosquitos, e, mais geralmente, é relevante para o uso da edição do genoma CRISPR/Cas9 para qualquer espécie de inseto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta métodos para introduzir mutações específicas no genoma dos mosquitos Culex e pode ser usado para editar o genoma de outros mosquitos também. O protocolo é significativo na medida em que fornece detalhes específicos não apenas de como preparar os materiais de injeção, mas também uma visão detalhada de vídeo de como induzir mosquitos a colocar ovos, bem como como preparar e injetar esses ovos. Também resumimos como aproveitar a biologia do Cx. pipiens feminino para c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. David O’Brochta e a todos os membros da Rede de Pesquisa de Coordenação de Tecnologias Genéticas de Insetos pela ajuda e treinamento que eles nos fornecem e outros sobre a implementação de tecnologias genéticas. Agradecemos especialmente a Channa Aluvihare por otimizar o protocolo de micromanipulação para permitir que embriões Culex sejam injetados e hatch. Agradecemos também a Devante Simmons e Joseph Urso, estudantes de graduação que trabalham no laboratório Meuti, por sua assistência ao cuidado e triagem de mosquitos transgênicos, e Zora Elmkami, da ITF, por assistência à criação e preparação de mosquitos para injeção. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Sementes Interdisciplinares do Instituto de Doenças Infecciosas da OSU fornecida ao MEM.
Materials
| Artificial Membrane Feeder | Hemotek | SP5W1-3 | Company location: Blackburn, UK |
| ATP | Invitrogen | 18330019 | Company location: Carlsbad, CA, USA |
| Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | World Precision Instruments | 1B100-6 | Company Location: Sarasota, FL, USA |
| BV10 Needle Beveler | Sutter Instruments | BV-10-B | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Whatman Circular filter paper (12.5 cm) | Sigma Aldrich | WHA1001125 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Conical tube (50 mL) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Fisherbrand course filter paper with fast flow rate | Thermo Fisher Scientific | 09-800 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Cover glass (24 x 40 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-311-20 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Dental dam | Henry Schein Inc | 1010171 | Company Location: Melville, NY USA |
| Scotch double-sided tape | Thermo Fisher Scientific | NC0879005 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| FemtoJet 4i microinjector | Eppendorf | 5252000021 | Company Location: Hamburg, Germany |
| Glass vial (2 dram) | Thermo Fisher Scientific | 033401C | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Halocarbon oil | Sigma Aldrich | H8898-50ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| P-2000 Laser Needle Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | Company Location: Nobato, CA, USA |
| Parafilm | Thermo Fisher Scientific | 50-998-944 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| PC-100 Weighted Needle Puller | Narishige | PC-100 | This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA |
| Phire Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F140WH | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Kodak Photo-Flo (1%) | Thermo Fisher Scientific | 50-268-05 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter | Capillary Tube Supplies Limited | QGCT 1.0 | Company Location: Cornwall, UK |
| Guide-it™ sgRNA Screening Kit | Takara, Bio USA | 632639 | This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Company Location: St. Louis, MO, USA |
| Small petri dishes (35X10 mm) | Thermo Fisher Scientific | 50-190-0273 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Sodium citrate chicken blood | Lampire biologicals | 7201406 | Company Location: Everett, PA, USA |
| Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875711A | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Tegaderm | Henry Schein Inc. | 7771180 | Company Location: Melville, NY USA |
| Tropical fish food | Tetramin | N/A | |
| Whatman filter paper | Thermo Fisher Scientific | 09-927-826 | Company Location: Waltham, MA, USA |
| Whatman filter paper, 4.25 cm | Sigma Aldrich | 1001-042 | Company Location: St. Louis, MO, USA |
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