Summary
我々は、CTスキャン由来の3Dプリントされた肺モデルを調整可能な空気流れプロファイルを用いて、ローブレベルで局所肺堆積を定量化するための高スループットのin vitro方法を提示する。
Abstract
肺疾患に対する標的療法の開発は、局所エアロゾルの送達を予測する能力を有する前臨床試験方法の利用可能性によって制限される。3Dプリンティングを活用して患者固有の肺モデルを生成し、小葉肺沈着を定量化するための高スループットのインビトロ実験セットアップの設計を概説する。このシステムは、市販のコンポーネントと3Dプリントされたコンポーネントの組み合わせで作られており、肺の各ローブを通る流量を独立して制御することができます。蛍光エアロゾルを各ローブに送達し、蛍光顕微鏡を用いて測定する。このプロトコルは、患者の人口統計および疾患状態の広い範囲をモデル化する能力を通じて呼吸器疾患のための個別化医療の成長を促進する可能性を有する。3Dプリントされた肺モデルの幾何学と空気流れプロファイル設定の両方を容易に変調し、年齢、人種、性別の変化を有する患者の臨床データを反映することができる。ここに示す気管内チューブのような臨床的に関連する薬物送達装置は、肺の疾患領域への治療的送達を標的とする装置の能力をより正確に予測するために、試験セットアップに組み込むことができる。この実験的なセットアップの多様性は、それが吸入状態の多数を反映するようにカスタマイズすることができ、前臨床治療試験の厳しさを高める。
Introduction
肺がんや慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの多くの肺疾患は、疾患特性の地域差を示す。しかし、肺の病気の領域にのみ薬物送達を標的にするために利用可能な治療技術の欠如がある 1.複数の計算流体動的(CFD)モデルは、肺2,3の特定の流線を特定することによって薬物堆積プロファイルを調節することができることを実証した。地域ターゲティング機能を備えた吸入器と気管内炎(ET)チューブアダプターの開発は、病気の肺領域へのエアロゾル分布を制御するために、当社の研究室で進めています。臨床使用にこれらの原則の延長は、現在の前臨床試験能力によって制限される。肺内の薬物沈着物の正確な位置は、有効性の最良の予測値であることが知られている;しかし、吸入可能な治療薬の現在の医薬品評価は、単に近似堆積物に粒子サイズのin vitro-in vivo相関を使用して最も頻繁に予測される。この手法では、空間解析を行って、肺の各種ローブを通る地域分布に対する異なる気道ジオメトリの影響を判断することはできません。さらに、このテストは解剖学的に正確な肺の幾何学を欠いている、研究者が示している堆積プロファイル5に大きな影響を与えることができる。上気道の追加を通じて、患者固有の肺形状を試験プロトコルに組み込むためのいくつかの努力がなされている。しかし、これらのアプローチのほとんどは、各肺の葉6、7、8ではなく、肺の様々な世代へのエアロゾルの送達をサンプリングする。以下のプロトコルは、肺9の5つのローブのそれぞれで相対粒子堆積を定量化する能力を有する患者固有の肺モデルを生成するハイスループット方法を提示する。
解剖学的に正確なモデルの肺は3D印刷の患者コンピュータ断層撮影(CT)スキャンによって生成される。容易に組み立てられる流動システムと組み合わせて使用する場合、各モデル肺のローブを通る相対的な流量は、独立して制御され、異なる患者の人口統計および/または疾患状態のものを模倣するように調整することができる。この方法により、研究者は、関連する肺幾何学における潜在的な治療方法の有効性をテストし、各方法の性能を疾患形態の進行と相関させることができる。ここでは、私たちの研究室で開発された2つのデバイス設計は、口や気管内のエアロゾル放出の位置を制御することによって、所望の肺ローブの堆積物を増加させる能力についてテストされています。このプロトコルはまた、患者のCTスキャンデータに特異的なモデル肺における治療有効性の迅速な予測を促進することによって、患者のためのパーソナライズされた手順の開発に大きな影響を与える可能性を有する。
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Protocol
1. 3Dプリント実験部品の製造
注: プロトコルで使用されるすべてのソフトウェアは、 資料表に示されています。さらに、使用されるスライスソフトウェアは、 資料一覧に記載されている3Dプリンタに固有のものです。ただし、このプロトコルは、ステレオリソグラフィ (SLA) 3D プリンタの広い範囲に拡張することができます。
- 患者CTスキャンを3Dオブジェクト(.stlファイル)に変換します。
注: これらの研究で使用される特定の肺モデルの幾何学的特徴についての詳細な説明は、風らら5を参照してください。- CT スキャン ソフトウェアを使用して CT スキャンを 3D オブジェクトにレンダリングします (「 材料表」を参照)。CT スキャンを開き、-800 ~ -1000 の範囲の設定を使用して [しきい値] ツールを使用して空域にマスクを作成します。 3D プレビュー ツールを使用して、3D レンダリングを表示し、オブジェクトを書き出す (ファイル |) を .stl ファイルとしてエクスポートします。
- ファイルをメッシュ編集ソフトウェアにインポートする(「表」を参照)は、選択ツール(スカルプト|) を使用して、ジャグジャグフィーチャを削除します。ブラシ: 「シュリンク/スムース」|プロパティ: 強度 (50), サイズ (10), 深さ (0)).サーフェスを滑らかにする(Ctrl +A ||の変形滑らかな|スムージング (0.2)、スムージング スケール (1) )。
- メッシュ編集ソフトウェアでは、これらのオブジェクトの壁を 2 mm 延長します(Ctrl+A ||の編集オフセット) をクリックし、内側のオブジェクトが壁だけが残るように中空のままにします。オブジェクトをスライスする([選択]||の編集気管で平面カット)を形成して入口を形成し、世代2または3ではオブジェクトが各ローブに分岐して出口を作成する(図1A)。
注: 厚さ 2 mm は、 材料表に記載されている 3D プリンタの製造元によって指定された許容可能な機能サイズに基づいて選択されました。この厚さは、モデルの内部ジオメトリが維持されている場合、利用可能な 3D プリンタの仕様に基づいて調整できます。
- 材料表に記載されている、以前に設計されたローブ出口キャップコンポーネント(図1B,C)と互換性があるように、患者 の肺モデルの出口ジオメトリを修正します。
- 内部のCTスキャンを複製する3Dオブジェクトは、壁厚が2mmで、入口と出口で開いている3Dモデリングソフトウェア( 材料表を参照)にソリッドボディ(開|) としてインポートします。メッシュ ファイル |オプション|ソリッドボディ)。
- 各コンセントの面に基づいて平面を作成する (挿入|参照ジオメトリ|平面)。スプライシングツールを使用して、平面上のスケッチ内のコンセントの内壁と外壁をトレース|スプライン)。
- モデルの内壁と外壁に接続するために、シリンダー(OD 18.5 mm、ID 12.5 mm、H 15.15 mm)をロフトし、各ローブで均一にする出口を伸ばします(特徴|ロフトボス/ベース).キャップに合わせて、アウトレットのエッジの周りにノッチを追加します (機能|押し出しカット|オフセット)。
注: キャップ (図 1D)は、コンセントの寸法に一致する中空のシリンダで、モデルのコンセントのノッチと相互接続する棚があります。キャップの一方の端は、IDが部品の残りの部分よりも小さくなるようなブロックされ、これは、有刺鉄線の結びつきの周りにしっかりとフィットすることを保証します(図1E)。有刺鉄管接続は、バービングがキャップの開口部を通して収まるように有刺鉄線状のコーン形状ですが、残りの部分は、チューブ接続がキャップにしっかりと収まるようにしません。したがって、キャップは有刺鉄線のチューブ接続と肺モデルの両方の周りにしっかりと収まります(図1F,G)。 - 所望の実験条件に応じて、肺モデルの入口を修正する。咽喉および血嚢領域は、自分で呼吸できる患者を模倣するために含めることができる(図1B)。気管の上の領域は、人工呼吸器のサポート上の挿管された患者を模倣するために押し出されたカットを使用して除去することができる(特徴|押し出しカット) (図 1C)
- 3Dプリンタメーカーが提供するスライスソフトウェアの実験コンポーネントを向き、サポートします。
- 3Dプリンタスライスソフトウェアに3Dパーツファイルをインポートし、適切な樹脂を選択します。硬質樹脂を使用して肺モデルと有刺鉄線の接続を印刷し、キャップを印刷するソフトレジンを使用します。
注:キャップの印刷に使用される樹脂は、ローブの出口の上に伸びて気密シールを作成できるように弾性特性を持っている必要があります。 - 「アイランド」と未発明のボリュームが最小化されるように、部品の向きを設定します。肺モデルのための最もよい向きは印刷プラットホームから離れて向いているローブの出口である。有刺鉄線の接続とキャップの両方が印刷プラットフォームに面した広い部分を持っていることを確認します。
注: 個々のスライスを表示して、パーツの本体に接続せずに、最初にスライスに表示される部分の「アイランド」の外観を確認できます。レビュー機能を使用すると、未開発のボリュームを持つスライス、未硬化樹脂が印刷中に部品の内部に閉じ込められる領域をチェックすることができます。「島」と未発明のボリュームの両方が印刷品質を低下させ、印刷障害につながる可能性があります。 - 各スライスを個別に表示し、パーツ内の残りの「アイランド」と、大きな張り出しがある領域にサポートを追加します。印刷用のスライスをエクスポートして表示し、すべての領域が適切にサポートされていることを確認します。
- 3Dプリンタスライスソフトウェアに3Dパーツファイルをインポートし、適切な樹脂を選択します。硬質樹脂を使用して肺モデルと有刺鉄線の接続を印刷し、キャップを印刷するソフトレジンを使用します。
- メーカーの指示に従って、実験コンポーネントと完全な後処理を印刷します。
注: 以下に説明する処理後の手順はすべて、 資料一覧に記載されている 3D プリンタに固有のものです。代替プリンタまたは材料を使用する場合は、製造元の指示に合わせてこれらの手順を調整します。- ソフト樹脂で印刷された部品の場合は、≥99%純度イソプロピルアルコール(IPA)で洗浄し、メーカー仕様に従って8時間の対流オーブンで過剰な未硬化樹脂とサーマルキュアを除去します。
注:柔らかい樹脂で印刷された部品は、印刷直後に非常に繊細になる可能性があるため、クリーニングの段階では特別な注意が必要です。IPAへの暴露は、部品の劣化を防ぐために、材料の溶媒暴露限界以下に保つべきである。 - 硬樹脂で印刷されたパーツの場合は、IPAで洗浄して過剰な未硬化樹脂を除去し、UVオーブン(5-10 mW/cm2で365 nm光)で1回1分間硬化します。
注:3Dプリントレプリカの精度を評価するには、印刷された部品とCTスキャンソフトウェアのμCTスキャンを使用して、元の3Dレンダリングと3Dプリントレプリカの間の変動を定量的に比較することをお勧めします。
- ソフト樹脂で印刷された部品の場合は、≥99%純度イソプロピルアルコール(IPA)で洗浄し、メーカー仕様に従って8時間の対流オーブンで過剰な未硬化樹脂とサーマルキュアを除去します。
流量制御のための管システムの2.アセンブリ
- ネジ 1/4"有刺鉄管継手は、6つのポート(図2A-6)と残りのポートに取り付けられた3/8"有刺鉄管を備えたマニホールドの側面に取り付けます。
- 1/4"チューブを所望の長さにカットし、プッシュ接続バルブの両端に挿入します(図2A-5)。マニホールドに挿入された 1/4 インチの継ぎ手の 1 つに各バルブを取り付けます。
- 流量計(図2A-4)を各バルブの反対側に接続します。
- マニホールドのシングル3/8"フィッティングがボードの端を越えて伸びるような木製ボードの上にチューブシステムを配置します。所定の位置に固定するには、木製のボードの側面に2本のネジを追加し、ワイヤーを使用してマニホールドをネジに取り付けます。
- 各バルブと流量計の周囲に4本のネジを追加し、ワイヤーを使用して各ねじを木製ボードに固定します(図2E)。
- 3/8インチIDチューブの約6"で、マニホールドをインライン0.1 μmの細孔サイズ真空グレードフィルターに接続します。3/8"IDチューブの別の6"を使用して、フィルタのもう一方の端をフローコントローラに接続します。
メモ:チューブシステムは一度だけ組み立てる必要があります。
患者の肺モデルが付いているローブ出口の帽子のアセンブリ
注: プロトコルのこの部分は、実験を行う前に完了する必要があります。
- キャップベースの開口部にノズルが突き出ている状態で、有刺鉄線チューブ接続をキャップに挿入します。まず、楕円形の有刺鉄線の接続ベースの一方の端をキャップに挿入します。その後、楕円形のベースの反対側に慎重に柔軟なキャップを伸ばし、細いベースを割らないように特別な注意を払います。
注:新しく印刷されたキャップは、希望よりも硬く、キャップの内部に沿って2本の指を走らせると伸ばすことができます。 - 10μmのフィルター紙を、出口面積より若干大きくカットします。ろ取り紙をローブの出口の上に折り、片手で所定の位置に保持します。
- 一方、ピンセットを使用して、コンセント上に有刺鉄線のチューブ接続でキャップを伸ばします。キャップのノッチがローブの出口の対応するノッチと一致するまでキャップを押し下げる(図2C)。
注: このステップでフィルターペーパーをリッピングすると結果が無効になる可能性があるため、キャップをコンセントに押し込む際の過度の力を避けるために特別な注意が必要です。 - 残りのすべてのローブアウトレットに対して繰り返します(図2D)。
4. 臨床的に関連する空気流れプロファイルの生成
注: プロトコルのこの部分は、実験を行う前に完了する必要があります。
- 各肺モデルローブ出口を対応する流量計とバルブのチューブに接続し、有刺鉄線チューブ接続に横方向の圧力をかけすぎないように注意してください。電子流量計を肺モデルの口口に取り付けて、肺モデルへの全空気流量を測定します。
- フローコントローラ(図2A-7)と真空ポンプ(図2A-8)をオンにします。フロー コントローラの [テストの設定] 設定を選択し、電子流量計に目的の合計流量が表示されるまで流量をゆっくり上げます。
- バルブを使用して(図2E-5)、右上(RU)、右中央(RM)、右下(RL)、左上(LU)、左下(LL)の5つの肺ローブのそれぞれを通して流量を調整します。流量計(図2E-4)に示すローブ流量が希望の値で安定したら、電子流量計の全体的な流量を再度確認して、システムに漏れが発生していないかどうかを確認します。
- 全体の流量に不一致がある場合は、流量コントローラで流量を下げ、すべてのバルブを完全に開いた構成に設定し、手順 4.2 と 4.3 を繰り返します。
注:ここで示した結果は、Sul et al.10によって報告されたデータに基づく空気流れプロファイルを用いて得られたものであり、これらのロバーフロー画分は、患者の肺の薄いスライスコンピュータ断層撮影画像を使用して完全なインスピレーションおよび満了時に計算し、各肺葉の体積の相対的な変化を比較した。結果は、2つの異なる流れ条件(両方とも1 L/minの全体的な流入流量)に対して提示されます。健康な肺葉出口流れプロファイルは、入口流量の次の割合によって各出口に分配されます:LL-23.7%、LU-23.7%、RL-18.7%、RM-14.0%、RU-20.3%。COPDローブ出口流れプロファイルは、入口流量の次の割合によって各出口間に分配される:LL-10.0%、LU-29.0%、RL-13.0%、RM-5.0%、RU-43.0%9、10。
- 全体の流量に不一致がある場合は、流量コントローラで流量を下げ、すべてのバルブを完全に開いた構成に設定し、手順 4.2 と 4.3 を繰り返します。
- フローコントローラの"テスト設定"機能を終了しますが、真空ポンプはオンのままにします。
注: 流量の設定と堆積実験の間に真空ポンプをオフにすると、生成されるフロープロファイルの不正確さにつながります。エアロゾル蒸着試験を完了するために望ましい流量が設定されたら、真空ポンプをオンにしておくことをお勧めします。
5. 肺モデルへのエアロゾルの送達
注:実験は、噴霧器によって生成されたエアロゾルへの暴露を最小限に抑えるために、サッシを閉じた状態でヒュームフードで行う必要があります。
- 目的の蛍光粒子の溶液でネブライザーを充填し(図2A-1)、肺モデルインレットに接続する(図2B)。
注:ここで示した結果は、メタノール中の1μm蛍光ポリスチレン粒子の1:100希釈の30 mLを使用して得られた。- 実験の設定を検証するには、ターゲットデバイスなしで、ネブライザーを直接肺モデルの入口に接続します。
- ターゲットデバイスの有効性を測定するには、ネブライザーをデバイスに接続し、装置を肺モデルに挿入します。
- 圧縮空気ラインをネブライザーに接続し、ヒュームフードサッシをできるだけ閉じます。
- 10 の試行で実行するようにフロー コントローラーを設定します。スタートボタンを押す前に、圧縮空気バルブを少し開けて、ネブライザー内でエアロゾルの発生を開始します。
- フローコントローラの[start]を押して、圧縮空気バルブをすぐに完全に開きます。フローコントローラが約9 sに達したら、圧縮空気バルブを閉じ始めます。
- 圧縮空気バルブが完全に閉じられたら、ネブライザーを圧縮空気ラインから外し、ヒュームフードサッシを完全に閉じ、真空ポンプを遮断し、エアロゾルを煙フードから約10分間クリアします。
メモ:真空がチューブシステム内に蓄積するのを防ぐために、実行が完了した後に真空ポンプをオフにすることが重要です。 - 十分な時間待った後、肺モデルをチューブシステムから切り離し、有刺鉄線のチューブ接続をクラックしないように特別な注意を払ってください。
- キャップの端の下にピンセットを実行し、肺モデルからそっと持ち上げることによって、ローブアウトレットキャップを取り外します。
- キャップから濾紙を取り出し、プレートのウェルに面した底面に堆積した粒子の側面を持つ24のウェルプレートに入れる。残りの出口に対して繰り返し、各ローブに対応するウェルにラベルを付けます。
注: 残留粒子の堆積が後続の実験に影響を与えないようにするには、肺モデルとキャップコンポーネントの両方をIPAまたは実行の間に適切な溶媒でリンスすることが重要です。これは、必要に応じて収集して分析に含めることができます。さらに、使用されるすべてのレプリカが部品の整合性を維持するために IPA に最小限の公開されていることを確認するためのログが保持され、使用前に部品の目視検査が推奨されます。
6. アウトレットフィルターペーパーイメージング
- ウェルプレートをデジタル蛍光顕微鏡に入れ、顕微鏡を4倍の拡大と適切な蛍光チャネルに設定します。
- 粒子の堆積量が最も多いローブのフィルターペーパーを視覚的に識別し、「オートエクスポーズ」機能を使用します。結果の露出と統合時間の値をメモします。
- この露出を実行のすべてのフィルターに適用し、この設定によってフィルターのすべての高い堆積領域に対して満足のいくイメージが生成されるかどうかを評価します。
注: フォーカス設定はフィルタからフィルタに変更できます。ただし、特定の実行のすべてのフィルターは、同じ露出設定で分析する必要があります。一度に1つの焦点フレームしか持てないので、濾紙の曲げや涙は、ビュー内のすべての堆積粒子が焦点を合わせないようにすることができます。これは、フィルターペーパーがウェルプレートの底部に対して平らであることを確認することによって回避することができます。 - 各ローブのフィルター用紙の画像をランダムな場所で少なくとも3枚撮り、.tiffファイルとして保存します。
7. 粒子蒸着の定量化
- 特定の実行のすべてのフィルター ペーパーの画像を ImageJ セッションにインポートします。
- [イメージ] を選択して各イメージの種類を 8 ビットに変更 |タイプ|8ビット。
- 蛍光が最も高い画像を開き、[ 画像||を調整するしきい値 ウィンドウを開くしきい値。しきい値を調整して、フィルタペーパーからのバックグラウンド信号を最小化し、パーティクルのエッジを明確に定義します。良質および低品質のしきい値の描写については 、図 3 を参照してください。
注:高い濃度の蒸着を有するフィルタの場合、濾紙繊維による光の回折によって引き起こされる蛍光の「コロナ」は、粒子の大きなグループの周りに観察され得る。これらの画像を閾値にする場合、大きすぎる範囲は、 図3の「不良」しきい値画像に見られるような、これらのグループの周りに小さな点または「羽のような」形状を表示する。これは、粒子自体からの信号を隠すことなく、濾紙繊維からの信号が最小化されるまで、閾値の下限を徐々に増加させることによって改善することができる。 - 蛍光画像の閾値設定を他のすべての画像に伝播します。
- [分析]を選択して、パーティクル数と蛍光領域全体を定量 化|パーティクルの解析:
注: データセットは、シダックの多重比較テストと双方向の分散分析を使用して比較されます。さらに、関心のあるローブのみの堆積は、等分散を想定して学生T検定を使用して比較されます。
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Representative Results
このサイズ範囲(1~5 μm)および流れ条件(1-10 L/min)の粒子は、理論上のストークス数とインビボデータの両方に基づいて流体流れ線に従います。したがって、標的送達装置がない場合、肺モデルに放出された粒子は、各ローブに流用された全気流の割合に従って沈着することが予想される。各ローブへの粒子送達量の相対的量は、患者固有の高解像度コンピュータ断層撮影(HRCT)スキャン10を分析することによって得られた臨床ローブ流量データと比較することができる。検証された実験的セットアップは臨床空気流のプロフィールと統計的に有意な差がない非標的粒子の沈着プロフィールを生み出す。検証データは、正常な肺の1 L/分(図4A)とCOPDの影響を受ける肺の1 L/分の2つの異なるフロー条件に対して提示されます(図4B)。これらの条件の両方の下で、実験的に決定された堆積プロファイルは臨床データと統計的に異ならず、セットアップが各肺葉への空気流の分布を正確に模倣することを実証した。これらのベースライン堆積プロファイルは、ターゲット粒子堆積プロファイルを比較する制御として役立った。
このプロトコルが局所的な肺沈着の変化を定量化する能力を説明するために、修飾気管内膜(ET)チューブ(図5B)と同心円筒装置(図5E)の2つの異なる標的化装置のテストのためのデータが含まれていた。これらのデバイスは、ターゲット粒子放出のためのチューナブルな位置を持つ2mm ID出口を特色にしました。改変されたETチューブは、左下(LL)ローブおよび右下(RL)ローブの両方に粒子沈着を標的とする能力について挿管された肺モデルで評価した。非標的粒子堆積プロファイルと比較して、このデバイスは、配信された粒子の96%以上を左肺(T-test p=0.0001、n=3)に転用することに加えて、LLローブ送達量のほぼ4倍の増加を生み出した(図5A)。RLローブをターゲットにリリース位置設定を変更すると、このデバイスはRLローブへの粒子送達を2倍以上生成し(T-test p=0.02,n=3)、送出された粒子の94%を右肺に転用した(T-test p=0.0005、n=3) (図5C)。これは、デバイスが意図したデポジションプロファイル変調を生成する上で非常に成功していることを示しています。同心円筒装置は、左上(LU)ローブの意図されたターゲットを持つ完全な肺モデルでテストされた。非標的粒子堆積プロファイルと比較して、このデバイスは、配信された粒子の87%以上を左肺(T-test p=0.002、n=3)に転用することに加えて、LUローブ送達量のほぼ3倍の増加を引き起こした(図5D)。ターゲット効率はまた、他の出口フィルタとターゲットローブフィルタの画像を比較することによって定性的に観察することができる。 図3に示すように、最も効果的なターゲティング法は、目的のローブに高い粒子堆積を生じ、残りのローブ出口で低い堆積物を得る。このプロトコルの機能のさらなるデモンストレーションについては、 Koleweら9によって行われた実験を参照してください。
図1:3Dプリント実験コンポーネント。(A)患者CTスキャンはCTスキャンおよびメッシュ編集ソフトウェアを使用して3D部品ファイルに変換した。(B)メッシュ編集と3Dモデリングソフトウェアで行われたローブ出口の変更を伴う肺モデル。(C)挿管された患者を反映するために3Dモデリングソフトウェアで変更された入口を有する肺モデル。(D)バービングチューブ接続と(E)キャップは、3Dモデリングソフトウェアで設計されています。(F)3Dモデルの断面は、キャップと有刺鉄線のチューブ接続を備えた肺モデルの出口の連動性を描いた。(G)肺モデルアウトレットキャップアセンブリの分解図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:実験用セットアップの組み立て(A)(1)ネブライザーを含む実験用セットアップの概略、(2)肺モデル、(3)出口キャップ、(4)流量計、(5)バルブ、(6)マニホールド、(7)流量制御装置及び(8)真空ポンプ。(B) 完全に組み立てられたセットアップ。(C)組み立てられたキャップ付きローブ出口のクローズアップ。(D)すべてのキャップが追加された肺モデル。(E) ローブ出口流量を設定するためのチューブネットワークのクローズアップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:紙の画像処理をフィルタする。提示された生の画像は、健康な呼吸プロファイルの下で1 L /minで1μm蛍光ポリスチレン粒子を使用して左肺を標的とする実験中に収集された。「高」と「低」の堆積画像は、それぞれLLとRUローブフィルターを示しています。43~255の範囲で適用される「良い」しきい値は、個々の粒子間の定義済みのエッジを維持し、フィルターペーパー繊維の検出を回避します。「不良」しきい値は、17 から 255 の範囲で適用され、個々の粒子の境界をあいまいにし、フィルターの蛍光領域を過大評価します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 実験用セットアップ検証(A) 健康な患者の検証結果と、 (B) 1 L/分の COPD 患者提示されたすべてのデータは、3つの複製を伴う平均±SDである(臨床COPDデータを除き、患者が1人しか報告されなかった)。健康およびCOPD患者に対する臨床参照データは、スル、他の10から得られた。データセットはシダックの多重比較テストを使用して比較され、すべての違いは有意ではありません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ターゲティング実験のデータ例(A)左下ローブと(C)修飾ETチューブ送達システムを使用して達成された右下ローブターゲティング。(D) 左上葉ターゲティングは同心円管送達システムを用いて達成した。3 つのデータ セットすべてについて、内側のリングはセットアップ検証中に取得された非ターゲット堆積プロファイルを表し、外側のリングは示されたターゲット デバイスを追加して生成された堆積プロファイルを表します。各セットアップに対して 3 つの反復の手段が示されています。データセットは、シダックの多重比較検定と等分散を想定した学生T検定を使用して比較されました。3つの設定はすべて、LLローブ(Tテストp=0.004、n=3)、RLローブ(Tテストp=0.02、n=3)、LU Lobe(Tテストp=0.0003、n=3)の、関心のあるローブへの配達が大幅に増加しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
完全吸入量の肺薬学的検査のための現在の最新式装置は、次の発電機インコンクター(NGI)であり、エアロゾル4の空気力学的直径を測定する。このサイジングデータは、健康な成人男性11のために開発された相関関係に基づいてエアロゾルが堆積する肺の生成を予測するために使用されます。残念ながら、この方法は、地域肺堆積の違いを評価し、医薬品の送達に及ぼす疾患の影響を決定し、様々な年齢層、人種、および性別12、13、14の堆積プロファイルを予測する能力において制限される。ここで概説するプロトコルは、研究者が計算モデル3、5、15で以前に示された流体流れの挙動に基づいて、ローブレベルで相対堆積を定量化する能力を持つ調整可能で解剖学的に正確な肺モデルを生成できるようにすることで、これらの試験ニーズを満たす能力を有する。この方法を使用すると、臨床試験に入る前に、小児および疾患肺幾何学についてより良い評価を行うことができる。
図4および図5に示すように、ローブレベルの堆積は、標的型および非標的吸入エアロゾルの両方について正確かつ迅速に測定することができる。ターゲットデバイスがない場合、このサイズ範囲(1〜5μm)および流れ条件(1-10 L/min)の粒子は、流体の流線と各ローブに転用された全気流プロファイルに従う(図4)。特に、様々な吸入器装置およびET管の付属品は制御されたlobbeの位置に吸入された薬を集中するために開発することができる。最近の研究や他の作業で説明したように、吸入器装置、流れプロファイル、および気道幾何学の多くの特徴は、目標とする堆積挙動2、3、9、16に寄与する。一般に、当社独自のin vitroモデルによって示されるように効率的な地域ターゲティングには、気管内で特に見られる気道の乱れを避けるために、狭いエアロゾルサイズ分布と低吸入流量が必要です。私たちのインビトロモデル内の完全な上部気道を含めることにより、下流のローブレベル分布9に影響を与えることを知られているこれらの気流パターンの正確なレクリエーションを可能にします。これらの複雑な流れのために、最近の研究は、グロティス9の下からターゲットを増加させました。我々の結果は、ETチューブアダプターを使用して、グロティスの下の放出から個々のローブを局所的に標的にすることの利点を具体的に強調し、全用量の62〜74%の効率で右肺と左肺の両方のローブに対して効率的なローブ特異的ターゲティングが示されている。これは、以前に実験的に報告された口放出地域ターゲティング効率に対する増加を表し、このアプローチ9の臨床実施のための重要な道である。重要なことに、このプロトコルは、ここで示されたものを超えて、幅広い潜在的な地域標的デバイスからの完全な医薬品投与量の実験的ローブ分布測定を可能にする。
CTスキャンのみで、患者固有の肺モデルを迅速に3Dプリントして、潜在的な治療的送達方法をテストすることができます。このプロトコルは、新しい吸入器デバイスの設計をサポートする実験的なラボ規模のアプローチを提供するだけでなく、臨床現場でオンデマンドでパーソナライズされた吸入装置の機会を創出します。このプロトコルで使用されるハード樹脂は、コストが〜$0.12 /mLです。したがって、既存の3Dプリンティングインフラストラクチャを持つ病院は、材料17でわずか15ドルの肺モデルを印刷し、1日の下でパーソナライズされた気道を組み立てることができます。特に、添加物製造における印刷時間と材料費は急速に減少し続けており、このアプローチの全体的な実現可能性が高まっています。我々の実験的なセットアップは、図4に示す実験検証に従って、異なる肺モデルまたは気流分布設定を利用して、いくつかの気流条件を反映するように容易に変更することができる。年齢、人種、性別などの特性による肺流れプロファイルと幾何学の違いは文献に十分に文書化されており、モデリングアプローチ18、19、20に容易に組み込むことができます。具体的には、肺モデルの喉頭、咽頭、気管の幾何学的変動は、気流およびその後の局所堆積パターン15、21、22に大きな影響を与える可能性があり、このプロトコルは検出に適しています。従って、このパーソナライズされたモデリング手法の組み込みは、カスタマイズされた吸入療法の開発に大きな影響を与えると予想される。
ここで、ローブ流量は、下葉への空気流量の減少を特徴とするCOPD疾患状態を反映するように変化したが(図4B)、COPD患者由来のCTスキャンは、疾患肺アーキテクチャおよび障害の可能性23をより正確に模倣するためにも使用できる。患者の肺モデルおよび流れのプロフィールのライブラリーによって、病気の進行が送達効率に及ぼす影響を調査することができる。国立衛生研究所(NIH)やがんイメージングアーカイブ(TCIA)24など、組織から利用可能なオープンソーススキャンの広い範囲があります。これらのモデルは現在、第2世代または第3世代まで患者の幾何学を複製してローブレベルの分布を適切に測定することができますが、より詳細な分析のために低気道を組み込むことができる変更を開発する作業が進行中です。このプロトコルは、 図 5Bに示すように、ET チューブなどの臨床的に関連する薬物送達装置を組み込むこともできます。研究者は、複数の配信装置を評価して、治療効率を増加または低下させる可能性のある特性を明らかにすることができます。例えば、挿管された肺モデルとは対照的に、完全な肺モデルで試みると、標的化効果が低下する(図5)。この違いは、眼区画領域をバイパスすると、ターゲティング能力を低下させる乱流混合領域を回避することを示しています。
このプロトコルは、生物学的空気液体界面を正確に模倣できないことによって制限される。その結果、慣性衝撃によって通常沈着するエアロゾルは、代わりに肺モデル25の硬直壁から跳ね返る可能性がある。これを改善するために、将来の方向には、肺上皮の粘膜層を模倣する表面修飾およびコーティングの探索が含まれる。シリコンオイルやグリセリンなどのコーティングは、NGIにおける粒子の跳ね返りを防止するために調査されており、3Dプリントされた肺モデル26に容易に組み込むことができる。3Dプリントモデル上の細胞のバイオプリンティングや培養などの他の技術は、細胞応答をプロトコル27に組み込む能力について調査されている。さらに、このプロトコルは、1~15 L/min の流速に最適化された装置を使用します。将来的には、30〜60 L/minの高い流量、ピーク吸気流量の正常範囲は、所望の流量範囲28、29に適したもののために制御バルブおよび流量計を切り替えることによって使用することができる。フローコントローラモデルを使用すると、システムは完全な周期的呼吸サイクルではなく、インスピレーションをモデル化することしか可能です。人工呼吸器またはより複雑なフローシステムを用いた一過性呼吸パターンの組み込みは、粒子蒸着効率30に関する実験結果の精度を向上させる可能性が高い。最後に、単分散蛍光ポリスチレン球体の1-5μmの範囲で堆積実験を行っただけです。沈着定量は、蛍光エアロゾルに依存するので、非蛍光エアロゾルとのこのプロトコルの使用は、分析31のための蛍光セインイソチオシアネート(FITC)などの蛍光標識の組み込みを必要とし得る。しかし、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)や質量分析などのエアロゾル組成物に応じて、追加の分析技術を適用してフィルタを分析することができます。
我々のプロトコルは患者固有の肺の幾何学の小葉肺の沈着を定量化する機能を用いる最初のin vitro実験のセットアップを証明する。制御されたローブレベルの分布を達成することは、吸入療法の治療効果を高めることが期待され、これはインビトロ全用量測定の進歩によってのみ達成される。個別化医療への関心の高まりに伴い、このプロトコルは、潜在的な治療効果のより正確な予測を可能にすることによって、新しい標的肺療法の開発に拍車をかける可能性を秘めています。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ユー・フェン教授、ジェナ・ブリデル博士、イアン・ウッドワード教授、ルーカス・アティア教授の有益な議論に感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
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