بروتوكول للكيمياء النسيجية المناعية وتوزيع الحمض النووي الريبي في الموقع داخل جنين ذبابة الفاكهة المبكر
Summary
هنا ، نصف بروتوكولا للكشف عن بروتين جنين ذبابة الفاكهة والحمض النووي الريبي وتوطينهما من الجمع إلى التضمين المسبق والتضمين ، والتلطيخ المناعي ، وتهجين الحمض النووي الريبوزي المرسال في الموقع .
Abstract
تلعب إشارات إطلاق الكالسيوم المستحثة بالكالسيوم (CICR) دورا حاسما في العديد من العمليات البيولوجية. ارتبط كل نشاط خلوي من تكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج ، والتطور والشيخوخة ، إلى اللدونة المشبكية العصبية والتجديد بمستقبلات ريانودين (RyRs). على الرغم من أهمية إشارات الكالسيوم ، فإن الآلية الدقيقة لوظيفتها في التطور المبكر غير واضحة. ككائن حي مع فترة حمل قصيرة ، فإن أجنة ذبابة الفاكهة هي مواضيع الدراسة الرئيسية للتحقيق في توزيع وتوطين البروتينات المرتبطة ب CICR ومنظميها أثناء التطور. ومع ذلك ، بسبب أجنة غنية بالدهون وكوريون غني بالكيتين ، فإن فائدتها محدودة بسبب صعوبة تركيب الأجنة على الأسطح الزجاجية. في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا عمليا يعزز بشكل كبير ارتباط جنين ذبابة الفاكهة بالشرائح ويفصل الطرق لنجاح الكيمياء النسيجية والكيمياء المناعية والتهجين في الموقع. تزيد طريقة طلاء شرائح الجيلاتين بالشبة المصنوعة من الكروم وطريقة التضمين المسبق للأجنة بشكل كبير من العائد في دراسة بروتين جنين ذبابة الفاكهة وتعبير الحمض النووي الريبي. لإثبات هذا النهج ، درسنا DmFKBP12 / Calstabin ، وهو منظم معروف ل RyR خلال التطور الجنيني المبكر لذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. حددنا DmFKBP12 في وقت مبكر من مرحلة الأديم الأرومي المخلوي وأبلغنا عن نمط التعبير الديناميكي ل DmFKBP12 أثناء التطوير: في البداية كبروتين موزع بالتساوي في الأديم الأرومي المخلوي ، ثم توطين مبدئي إلى الطبقة السفلية من القشرة أثناء الأديم الأرومي الخلوي ، قبل توزيعه في بنية الخلايا العصبية والهضم البدائية خلال مرحلة الطبقات الثلاث أحجار كريمة في المعدة المبكرة. قد يفسر هذا التوزيع الدور الحاسم الذي يلعبه RyR في أنظمة الأعضاء الحيوية التي تنشأ من هذه الطبقات: العقدة تحت المريء وفوق المريء ، والجهاز العصبي البطني ، والجهاز العضلي الهيكلي.
Introduction
تلعب إشارات إطلاق الكالسيوم المستحثة بالكالسيوم (CICR) دورا حاسما في العديد من العمليات البيولوجية ، مثل الهيكل العظمي / العضلات الملساء ووظيفة الأوعية الدموية القلبية ، وتكاثر الخلايا وموت الخلايا المبرمج ، والتنمية ، والشيخوخة ، واللدونة المشبكية العصبية ، والتجديد1،2،3،4،5،6 . مستقبلات الرايانودين (RyRs) ومستقبلات الإينوزيتول 1,4,5-trisphosphate (IP3Rs) هي لاعبين رئيسيين في مسار إشارات الكالسيوم الذي تسيطر عليه منظماتها بروتين كيناز A (PKA) ، كيناز البروتين المعتمد على Ca2 + / calmodulin II (CaMKII) ، بروتينات ربط FK506 (FKBPs) ، calsequestrin (CSQ) ، triadin ، و junctin1,2,3,4,5,6 . يمكن أن يؤدي التعبير البشري غير الطبيعي والطفرات في هذه البروتينات إلى فسيولوجيا مرضية مثل عدم انتظام ضربات القلب7 والانتشار الورمي8,9.
تنظم FKBPs إطلاق الكالسيوم من الشبكة الإندوبلازمية (ER) بواسطة RyRs. هذه العملية ضرورية لآلية الانكماش ، وبالتالي فهي مسؤولة عن جميع الحركات الميكانيكية الناتجة عن تقلص الميوسين أكتين من خلال إطلاق الكالسيوم الناجم عن الكالسيوم جنبا إلى جنب مع RyRs1,2 الجنيني. في نماذج الفئران ، يكون نقص RyR2 ومنظمه FKBP12 / Calstabin قاتلا دائما ، إما أثناء التطور الجنيني أو في فترة ما بعد الولادة المبكرة10،11،12. تظهر الفئران القاضية FKBP12 / Calstabin عيوبا قلبية حرجة مع اقتران الانقباض غير المنتظم للإثارة (EC) والوذمة الدماغية أثناء التطور الجنيني. وهذا يشير إلى أن FKBP12/Calstabin يلعب دورا أساسيا في تنظيم التعبير عن قناة RyR2، وهو أمر مهم لكل من تطور القلب والدماغ10.
تم اكتشاف شرارات الكالسيوم التي أجراها RyR في البداية في مرحلة تكوين الزيجوت لبيض ميداكا المخصب13,14. ومع ذلك ، تم إجراء عدد قليل من التحقيقات حول وظيفة إشارات الكالسيوم في التطور الجنيني المبكر. في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، توفر النتائج التي تم الحصول عليها من طفرات DmFKBP12 S107 أدلة قوية تدعم أهمية هذا الجين لتطور اليرقات وعمر صحي ، والذي يعزى إلى وظيفته ضد الإجهاد التأكسدي15,16. في الآونة الأخيرة ، حددنا التوطين الديناميكي لبروتين FKBP12 / Calstabin والحمض النووي الريبي الرسول خلال تطوير ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر المبكرة17. باستخدام الأساليب الموضحة في هذه المنهجية ، تمكنا من تتبع التعبير عن FKBP12 / Calstabin في D. melanogaster خلال الأديم الأرومي المخلوي (0-2 h) ، والأديم الأرومي الخلوي (2-3 h) ، و gastrula المبكر (3-12 h) ، و gastrula المتأخر (12-24 h). في هذه الورقة ، نقدم البروتوكولات التفصيلية لكل نهج في الدراسة السابقة ، بما في ذلك التضمين قبل الجنين لتقسيم البارافين الكلاسيكي ، ومعالجة شرائح ما قبل الطلاء للأقسام الجنينية ، وتلطيخ الكيمياء النسيجية والتلطيخ المناعي ، وتهجين mRNA في الموقع لتحديد التعبير الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد إشارات الكالسيوم بوساطة RyRs و IP3Rs مسارا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية لكل من الحيوانات الفقارية واللافقارية1،2،3،4. في البشر ، تؤدي الطفرات النقطية ، مثل طفرة R4496C المرتبطة ب CPVT ، في جين RyR2 إلى تسرب …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (#31771377 / 31571273 / 31371256) ، وبرنامج العلماء المتميزين الأجانب من وزارة التعليم الوطنية (#MS2014SXSF038) ، وصندوق أبحاث الجامعات المركزية التابع للإدارة الوطنية للتعليم (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) ، ويدعم XZ صندوق أطروحة الدكتوراه المتميز (#2019TS082 / 2019TS079) ، والبرنامج الرئيسي لإدارة التعليم في مقاطعة شنشي (#20JS138) ، مشروع شباب برنامج البحوث الأساسية للعلوم الطبيعية التابع لإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة شنشي (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
