Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.

Abstract

A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.

Introduction

A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinase A (PKA), ^Ca2+/calmodulin-dependent protein quinase II (CaMKII), FK506 proteínas vinculantes (FKBPs), calsequestrin (CSQ), tqdinria, tqdinria, tq e junctina1,2,3,4,5,6 . A expressão humana anormal e as mutações nessas proteínas podem levar à fisiologia patológica, como arritmias7 e proliferação oncogênica8,9.

FKBPs regulam a liberação de cálcio do reticular endoplasmico (ER) por RyRs. Este processo é essencial para o mecanismo de contração e, portanto, responsável por todo o movimento mecânico gerado pela contração miosina-actina através da liberação de cálcio induzida pelo cálcio, juntamente com ^ryRs1,2 embrionário. Nos modelos de mouse, a falta de RyR2 e seu regulador FKBP12/Calstabin é invariavelmente letal, seja durante o desenvolvimento embrionário ou no período pós-natal inicial10,11,12. Os camundongos eliminados FKBP12/Calstabin apresentam defeitos cardíacos críticos com acoplamento irregular de excitação- contração (CE) e edema cerebral durante o desenvolvimento embrionário. Isso indica que o FKBP12/Calstabin desempenha um papel essencial na regulação da expressão do canal RyR2, o que é importante tanto para o desenvolvimento cardíaco quanto ^cerebral10.

As faíscas de cálcio conduzidas pelo RyR foram inicialmente descobertas na fase de formação de zigotos de ovos Medaka ^{fertilizados13,14}. No entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a função da sinalização de cálcio no desenvolvimento embrionário precoce. Em Drosophila melanogaster, os resultados obtidos dos mutantes DmFKBP12 S107 fornecem fortes evidências que sustentam a importância desse gene para o desenvolvimento larval e uma vida útil saudável, que é atribuída à sua função contra o estresse ^{oxidativo15,16}. Recentemente, identificamos a localização dinâmica da proteína FKBP12/Calstabin e do RNA mensageiro durante o desenvolvimento inicial de Drosophila melanogaster17. Utilizando as abordagens descritas nesta metodologia, pudemos rastrear a expressão de FKBP12/Calstabin em D. melanogaster durante o blastoderm sincicial (0-2 h), blastoderm celular (2-3 h), gastrula precoce (3-12 h) e gastrula tardia (12-24 h). Neste artigo, apresentamos os protocolos detalhados de todas as abordagens do estudo anterior, incluindo incorporação pré-embrionária para secção clássica de parafina, tratamento de slides pré-revestimento para seções embrionárias, coloração de histoquímica e imunostaining, e hibridização mRNA in-situ para identificação da expressão genética.

Protocol

1. Preparação de pratos de ágar de suco de uva Adicione 5 g de ágar e 5 g de sacarose a 150 mL de água destilada. Ferva-o usando um micro-ondas até que o ágar e a sacarose estejam totalmente dissolvidos. Misture 50 mL de suco de uva 100% e a solução em conjunto. Adicione 1 mL de ácido 100% propiônico para fazer a concentração final a 0,5% de ácido propínico. Despeje 25 mL da solução preparada em cada placa. Depois que o ágar se solidificar, armazene a mídia em 4 °C…

Representative Results

As figuras descrevem protocolos usados para superar o desafio de anexar embriões de chorão de alta lipídica e de chitina (Tabela 1) à superfície do slide de vidro para exame e experimentação. Utilizando o método de revestimento de slides de gelatina cromada mostrado na Figura 1, aumentamos a fixação de embriões de Drosophila na superfície dos slides, enquanto o método de pré-incorporação de embriões mostrado na Figura 2…

Discussion

RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações aprese…

Materials

-20°C Refrigerator	Meiling Biology &Medical	DW-YL270	Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator	Thermo	Forma 90 Series	Used for regent storage
Agar	Sigma-Aldrich	WXBB6360V	Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments	Roche	11093274910	For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator	Shanghai Bluepard Instruments	LRH-250	In-situ Hybridization
Bouin's solution	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69945460	Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge	Eppendorf	540BH07808	In-situ Hybridization
Centrifuge tube	Denville	C-2170	Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10001018	Coating Slides
Constant temperature water bath	Jintan Henfeng Instruments	KW-1000DC	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System	Dako	K5007	In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit	Roche	11093274910	RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster	Bloomington Stock Center	BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664	The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven	Tianjin Taiste Instruments	101-0AB	For coating slides and paraffin embedding
Eosin	Sigma-Aldrich	230251	Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	100092680	Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10010328	Coating Slides
Gold chloride	Sigma-Aldrich	379948	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136	Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit	Roche	11732668001	For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box	Ningbo Jiangnan Instruments	HWS	For fly maintenance
LE Agarose	HyAgarose	14190108029	Pre-embedding
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10014108	Drosophila Embryo Collection
Microscope	ZEISS	Observer.A1	Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides	MeVid Labware Manufacturing	P105-2001	Coating Slides
Neutral Gum	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10004160	Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	40026768	Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer	Huahai science instrument	HH-2508III	In-situ Hybridization
Paraffin	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	69019461	Paraffin Embedding
pH/mV Meter	Sartorius	PB-10	For determing the pH value of a solution
Silver nitrate	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10018461	Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter	Thermo	AFXI-0501-P	In-situ Hybridization
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent at Beijing	10023418	Paraffin Embedding