ヒト脳組織からのタンパク質の多発反応モニタリングを用いた定量的プロテオミクスワークフロー
Summary
このプロトコルは、臨床サンプルからのタンパク質の多重反応モニタリング(MRM)のための三重四重極質量分析計の使用を導入することを目的としています。我々は、サンプル調製から臨床サンプルのデータ分析に始まる体系的なワークフローを提供し、必要な予防措置をすべて講じています。
Abstract
過去10年間の人間の脳組織のプロテオミクス分析は、脳の理解を大きく高めています。しかし、脳関連疾患は世界中の死亡の主要な貢献者であり続け、病態生物学をさらに深く理解する必要性が必要です。西洋ブロッティングや免疫体化学などの従来の抗体ベースの技術は、労働集約的で質的または半定量的であることに加えて、低スループットであることに苦しんでいます。従来の質量分析ベースの散弾銃アプローチでさえ、特定の仮説を裏付ける決定的な証拠を提供することができません。標的プロテオミクスアプローチは、主に仮説駆動であり、長く使用されてきた従来の散弾銃プロテオミクスアプローチとは異なります。多発反応監視は、タンデム四重極質量分析計または三重四重極質量分析計と呼ばれる特殊な質量分析計の使用を必要とするそのような標的型アプローチの1つである。今回の研究では、人間の脳組織を用いたタンデム四重極質量分析ベースのプロテオミクスワークフローを成功させ、より広範な研究コミュニティにこのワークフローを導入することを目的として、主要なステップを体系的に強調しました。
Introduction
過去10年間、質量分析(MS)の急速な発展とクロマトグラフィー技術の理解の向上が、MSベースのプロテオミクスの進歩に大いに役立っています。西洋ブロッティングや免疫組織化学などの分子生物学ベースの技術は、再現性の問題、ターンアラウンドタイムの遅さ、観察者間変動性、タンパク質を正確に定量化できないことに長い間苦しんできました。このことから、高スループットプロテオミクスアプローチの優れた感度は、細胞内のタンパク質の役割をよりよく理解するための代替的で信頼性の高いツールを分子生物学者に提供し続けています。しかし、ショットガンプロテオミクスのアプローチ(データ依存型取得またはDDA)は、多くの場合、機器の感度と分解能に大きく依存しているだけでなく、複雑な組織の低い豊富なタンパク質を検出することができません。ここ数年、世界中のラボは、これらの高度に複雑なデータセットを処理できるコンピューティングパワーと信頼性の高いソフトウェアを必要とするデータ・インディペンデント・アクイジション(DIA)のような技術を開発してきました。しかし、これらのテクニックはまだ進行中の作業であり、あまりユーザーフレンドリーではありません。標的MSベースのプロテオミクスアプローチは、MSアプローチの高スループット性とELISAのような分子生物学アプローチの感度との間で完璧なバランスを提供します。標的質量分析ベースのプロテオミクス実験では、発見ベースの散弾銃プロテオミクス実験または利用可能な文献1、2から仮説駆動のタンパク質またはペプチドを検出することに焦点を当てています。多発反応モニタリング(MRM)は、複雑なサンプルからのタンパク質/ペプチドの正確な検出と定量を行うタンデム四重極質量分析計を使用する、このような標的MSアプローチの1つです。この技術は、低解像度の機器を使用する必要があるにもかかわらず、より高い感度と特異性を提供します。
四重極は4つの平行棒から成り、各棒は斜め反対側の棒に接続される。RF電圧とDC電圧を交互に適用することにより、四重極ロッド間に変動分野が生まれます。四重極内のイオンの軌道は、反対側のロッド間に同じ電圧が存在することによって影響されます。RFを直流電圧に印加することにより、イオンの軌跡を安定化させることができる。それは選択的に特定のイオンを通過させることができる質量フィルターとして使用することを可能にする四重極のこの特性である。必要に応じて、四重極は静的モードまたはスキャンモードで動作させることができます。スタティックモードでは、指定されたm/zを持つイオンのみが通過できるため、そのモードは非常に選択的で、対象のイオンに固有のモードになります。一方、スキャンモードでは、m/z範囲全体のイオンが通過します。したがって、タンデム四重極質量分析計は4つの可能な方法で動作することができます:i)第2のスキャンモードで動作している間、静的モードで動作する最初の四重極。ii)第2の静的モードで動作している間、スキャンモードで動作する最初の四重極。iii)スキャンモードで動作する両方の四極子。とiv)両方の四極子が静的モード3で動作します。典型的なMRM実験では、両方の四重極が静的モードで動作し、断片化後に特定の前駆体および生成された製品を監視することができます。これは、技術が非常に敏感かつ選択的になり、正確な定量化を可能にする。
分子生物学者にとって、人間の脳組織とその細胞は宝庫です。人体の常に興味深い器官のこれらの顕著な単位は、その機能に分子および細胞の洞察を提供することができます。脳組織のプロテオミクスの調査は、健康な脳の全身機能を理解するのに役立つだけでなく、いくつかの疾患によって引き起こされたときに調節が不整合になる細胞経路を理解するのに役立つだけでなく、 4.しかし、そのすべての異質性を持つ脳組織は、分析する非常に複雑な器官であり、分子レベルでの変化をよりよく理解するための協調的なアプローチを必要とします。以下の研究は、脳組織からタンパク質を抽出することから始まる全てのワークフローを説明し、MRMアッセイの方法を作成し、最適化し、標的の検証に向けて説明する(図1)。ここでは、より広範な研究コミュニティに技術とその課題を導入することを目的として、ヒト脳組織を用いたMRMベースの実験の成功に関わる主要なステップを体系的に強調しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫体化学や西洋ブロッティングなどの技術は、長年にわたりタンパク質標的の検証のための金の基準と考えられていました。これらの方法は、プロトコルのわずかな変更と技術への依存がほとんどない今日でも使用を見つけ、非常に面倒で退屈です。さらに、バッチ間で常に同じ特異性を示すものではなく、多くの専門知識を必要とする高価な抗体の使用も含まれます。さらに、質量分析?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、MHRD-UAYプロジェクト(UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)、バイオテクノロジー省(BT/PR13114/INF/22/2015)が支援するIITボンベイのSSおよびMASSFIITB施設へのプロジェクト#34_IITBを認め、MS関連の実験をすべて実施します。
私たちは、ビデオ全体の制作と編集のためのリシャブ・ヤダフ氏とオーディオを編集する彼の仕事のためのニシャント・ネウルカー氏に私たちの特別な感謝を拡張します。
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
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