İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı
Summary
Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.
Abstract
Son on yılda insan beyin dokusunun proteomik analizi beyin anlayışımızı büyük ölçüde artırdı. Bununla birlikte, beyinle ilgili bozukluklar, patobiyolojilerinin daha da fazla anlaşılması ihtiyacını gerektiren, dünyadaki ölümlerin önemli bir katkısı olmaya devam ediyor. Batı şişkinliği veya immünhistokimya gibi geleneksel antikor bazlı teknikler, emek yoğun ve nitel veya yarı nicel olmanın yanı sıra düşük verimden muzdariptir. Geleneksel kütle spektrometresi bazlı av tüfeği yaklaşımları bile belirli bir hipotezi destekleyecek kesin kanıtlar sunamaz. Hedefli proteomik yaklaşımlar büyük ölçüde hipotez odaklıdır ve uzun süredir kullanımda olan geleneksel av tüfeği proteomik yaklaşımlarından farklıdır. Çoklu reaksiyon izleme, tandem dörtlü kütle spektrometresi veya üçlü dörtlü kütle spektrometresi adı verilen özel bir kütle spektrometresinin kullanılmasını gerektiren bu tür hedefli bir yaklaşımdır. Mevcut çalışmada, bu iş akışını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak başarılı bir tandem dörtlü kütle spektrometresi tabanlı proteomik iş akışının gerçekleştirilmesinde önemli adımları sistematik olarak vurguladık.
Introduction
Son on yılda, kütle spektrometreslerindeki (MS) hızlı gelişmeler ve kromatografi tekniklerinin daha fazla anlaşılması, MS tabanlı proteomiklerin ilerlemesine büyük ölçüde yardımcı oldu. Batı şişkinliği ve immünhistokimya gibi moleküler biyoloji tabanlı teknikler uzun zamandır tekrarlanabilirlik sorunları, yavaş geri dönüş süresi, gözlemciler arası değişkenlik ve proteinleri doğru bir şekilde ölçememelerinden muzdariptir. Bu amaçla, yüksek verimli proteomik yaklaşımların üstün duyarlılığı, moleküler biyologlara proteinlerin hücrelerdeki rollerini daha iyi anlama arayışında alternatif ve daha güvenilir bir araç sunmaya devam ediyor. Bununla birlikte, av tüfeği proteomik yaklaşımları (Veriye bağımlı Edinme veya DDA), genellikle cihazın hassasiyetine ve çözünürlüğüne büyük ölçüde güvenmenin yanı sıra karmaşık dokularda düşük bol proteinleri tespit edemez. Son birkaç yıldır, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar, daha fazla bilgi işlem gücü ve bu son derece karmaşık veri kümelerini işleyebilen güvenilir yazılım gerektiren Veri Bağımsız Edinimi (DIA) gibi teknikler geliştiriyor. Ancak, bu teknikler hala devam eden bir çalışmadır ve çok kullanıcı dostu değildir. Hedeflenen MS tabanlı proteomik yaklaşımlar, MS yaklaşımlarının yüksek verimli doğası ile ELISA gibi moleküler biyoloji yaklaşımlarının hassasiyeti arasında mükemmel bir denge sağlar. Hedefli kütle spektrometresi tabanlı proteomik deney, hipotez güdümlü proteinleri veya peptitleri keşif tabanlı av tüfeği proteomik deneylerinden veya mevcut literatür1,2aracılığıyla tespit etmeye odaklanır. Çoklu Reaksiyon İzleme (MRM), karmaşık örneklerden proteinlerin/peptitlerin doğru tespiti ve nicelleştirilmesi için tandem dörtlü kütle spektrometresi kullanan bu tür hedefli bir MS yaklaşımıdır. Teknik, düşük çözünürlüklü bir cihazın kullanılmasını gerektirmesine rağmen daha yüksek hassasiyet ve özgüllük sunar.
Dörtgen, her çubuğu çapraz olarak karşı çubuğa bağlı olan 4 paralel çubuktan yapılmıştır. Dörtlü çubuklar arasında alternatif RF ve DC gerilimleri uygulanarak dalgalı bir alan oluşturulur. Dörtlünün içindeki iyonların yörüngesi, karşı çubuklar boyunca aynı voltajların varlığından etkilenir. RF’yi DC voltaja uygulayarak, iyonların yörüngesi stabilize edilebilir. Dörtlünün bu özelliği, belirli iyonların geçmesine seçici olarak izin verebilen bir kütle filtresi olarak kullanılmasına izin verir. İhtiyace bağlı olarak, bir dörtlü statik modda veya tarama modunda çalıştırılabilir. Statik mod, yalnızca belirli bir m/z’ye sahip iyonların geçmesine izin verir, bu da modu son derece seçici ve ilgi iyonlarına özgü hale getirir. Öte yandan tarama modu, tüm m/z aralığındaki iyonların geçmesine izin verir. Böylece, tandem dörtlü kütle spektrometreleri 4 olası şekilde çalışabilir: i) statik modda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise tarama modunda çalışır; ii) tarama modunda çalışan ilk dörtlü, ikincisi ise statik modda çalışır; iii) tarama modunda çalışan her iki dörtlü; ve iv) statik modda çalışan her iki dörtlü3. Tipik bir MRM deneyinde, her iki dörtlü de statik modda çalışır ve parçalanmadan sonra belirli öncüllerin ve elde edilen ürünlerinin izlenmesini sağlar. Bu, tekniği çok hassas ve seçici hale getirerek doğru niceleme sağlar.
Moleküler biyologlar için, insan beyin dokusu ve hücreleri bir hazinedir. İnsan vücudunun sürekli ilginç bir organının bu olağanüstü birimleri, işleyişi hakkında moleküler ve hücresel içgörüler sağlayabilir. Beyin dokusunun proteomik incelemeleri sadece sağlıklı bir beynin sistemik işleyişini anlamamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bazı hastalıklar tarafından ortaya çıktığında disregüle olan hücresel yolları da anlamamıza yardımcı olabilir4. Bununla birlikte, tüm heterojenliği ile beyin dokusu analiz etmek için çok karmaşık bir organdır ve moleküler düzeydeki değişikliklerin daha iyi anlaşılması için uyumlu bir yaklaşım gerektirir. Aşağıdaki çalışma, beyin dokusundan proteinlerin çıkarılmasından, MRM test yöntemlerinin oluşturulmasından ve optimizelanmasından hedeflerin doğrulanmasına kadar tüm iş akışını açıklar (Şekil 1). Burada, tekniği ve zorluklarını daha geniş bir araştırma topluluğuna tanıtmak amacıyla insan beyin dokusunu kullanarak yapılan başarılı MRM tabanlı bir deneyde yer alan önemli adımları sistematik olarak vurguladık.
Protocol
Representative Results
Discussion
İmmünohistokinoloji ve Batı şişkinliği gibi teknikler uzun yıllar boyunca protein hedeflerinin doğrulanmasında altın standartlar olarak kabul edildi. Bu yöntemler, protokoldeki küçük değişiklikler ve teknolojiye çok az bağımlılık ile bugün bile kullanım bulur ve bu da onları çok hantal ve sıkıcı hale getirir. Bunun yanı sıra, partiler arasında her zaman aynı özgüllüğü göstermeyen ve çok fazla uzmanlık gerektiren pahalı antikorların kullanımını da içerirler. Ek olarak, kütle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS ile ilgili tüm deneyleri gerçekleştirmek için Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR13114/INF/22/206/2015) tarafından desteklenen IIT Bombay’daki SS ve MASSFIITB Tesisi’ne #34_IITB MHRD-UAY Projesi’ni (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA) kabul ediyoruz.
Tüm videoyu yaptığı ve düzenlediği için Bay Rishabh Yadav’a ve sesi düzenleme çalışmalarından dolayı Bay Nishant Nerurkar’a özel teşekkürlerimizi sunuyoruz.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| TSQ Altis mass spectrometer | Thermo | TSQ02-10002 | |
| uHPLC – Vanquish | Thermo | VQF01-20001 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 |
References
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. , (2012).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: Best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Hosp, F., Mann, M. A Primer on Concepts and Applications of Proteomics in Neuroscience. Neuron. 96 (3), 558-571 (2017).
- Scopes, R. K. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Analytical Biochemistry. , (1974).
- Kusebauch, U., et al. Human SRMAtlas: A Resource of Targeted Assays to Quantify the Complete Human Proteome. Cell. , (2016).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2003).
- Escher, C., et al. Using iRT, a normalized retention time for more targeted measurement of peptides. Proteomics. , (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nature Methods. 10 (1), 28-34 (2013).
- Whiteaker, J. R., et al. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma. Nature Biotechnology. , (2011).
- Hüttenhain, R., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Science Translational Medicine. 4 (142), 94 (2012).
- Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).
- Koldamova, R. P., Lefterov, I. M., Lefterova, M. I., Lazo, J. S. Apolipoprotein A-I directly interacts with amyloid precursor protein and inhibits Aβ aggregation and toxicity. Biochimie. , (2001).
- Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia. Journal of Neurochemistry. , (2012).
- Liu, L. Y., et al. Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases. PLoS ONE. , (2012).
- Abbatiello, S., et al. New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins. Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).
