Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade
Summary
Hier stellen wir ein Sezierprotokoll zur Verfügung, das erforderlich ist, um die spätembryonale Drosophila-Gonade live zu fotografieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung dynamischer zellulärer Prozesse unter normalen Bedingungen oder nach transgener oder pharmakologischer Manipulation.
Abstract
Die männliche embryonale Gonade Drosophila melanogaster ist ein vorteilhaftes Modell, um verschiedene Aspekte der Entwicklungsbiologie zu untersuchen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Entwicklung von Keimzellen, die piRNA-Biologie und die Nischenbildung. Hier stellen wir eine Seziertechnik vor, um die Gonade ex vivo in einer Zeit live abzubilden, in der die Live-Bildgebung in vivo höchst ineffektiv ist. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Embryonen in eine Bildgebungsschale transferiert, geeignete männliche Embryonen auswählt und die Gonade aus ihrem umgebenden Gewebe seziert, während ihre strukturelle Integrität erhalten bleibt. Nach der Dissektion können Gonaden mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet werden, um dynamische zelluläre Prozesse zu visualisieren. Das Sezierverfahren erfordert präzises Timing und Geschicklichkeit, aber wir geben Einblicke, wie häufige Fehler vermieden und diese Herausforderungen überwunden werden können. Unseres Wissens ist dies das erste Dissektionsprotokoll für die embryonale Drosophila-Gonade und ermöglicht Live-Imaging während eines ansonsten unzugänglichen Zeitfensters. Diese Technik kann mit pharmakologischen oder zelltypspezifischen transgenen Manipulationen kombiniert werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen, die innerhalb oder zwischen den Zellen in ihrer natürlichen Gonadenumgebung ablaufen.
Introduction
Die Drosophila melanogaster testis hat als Paradigma für unser Verständnis vieler dynamischer zellulärer Prozesse gedient. Studien dieses Modells haben Aufschluss über die Stammzellteilungsregulation 1,2,3, die Keimzellentwicklung4,5, die piRNA-Biologie 6,7,8 und die Nischenstammzell-Signalisierungsereignisse 9,10,11,12,13 gegeben. Dieses Modell ist vorteilhaft, weil es genetisch behandelbar ist14,15 und eines der wenigen ist, bei denen wir Stammzellen in ihrer natürlichen Umgebung live darstellenkönnen 3,16,17,18. Die Live-Bildgebung dieses Modells war jedoch auf adultes Gewebe und frühe Embryonalstadien beschränkt, was eine Lücke in unserem Wissen über die Gonadendynamik im späten Embryo hinterlässt, dem genauen Stadium, in dem sich die Nische zum ersten Mal bildet und zu funktionieren beginnt.
Die embryonale Gonade im Spätstadium ist eine Kugel, die aus somatischen Nischenzellen im vorderen Bereich und Keimzellen besteht, die von somatischen Gonadenzellen in hintereren Regioneneingestreut werden 19. Dieses Organ kann live in vivo bis zum frühen Embryonalstadium 17 17,20,21 abgebildet werden. Eine weitere Bildgebung wird durch die Einleitung großflächiger Muskelkontraktionen verhindert. Diese Kontraktionen sind so stark, dass sie die Gonade aus dem Bildgebungsrahmen drücken, und eine solche Bewegung kann nicht mit einer Bildgebungssoftware korrigiert werden. Unser Labor ist daran interessiert, die Mechanismen der Nischenbildung aufzudecken, die während dieser schwer fassbaren Zeit für die Live-Bildgebung auftritt. Daher haben wir einen Ex-vivo-Ansatz entwickelt, um die Gonade ab dem Embryonalstadium 16 live abzubilden, was die Untersuchung der Zelldynamik während dieser entscheidenden Phase der Gonadenentwicklung erleichtert. Frühere Arbeiten aus unserem Labor zeigen, dass diese Ex-vivo-Bildgebung de vivo Gonadenentwicklung originalgetreu rekapituliert17. Diese Technik ist die erste und einzige ihrer Art für die embryonale Gonade Drosophila.
Hier stellen wir das Dissektionsprotokoll vor, das für die Ex-vivo-Live-Bildgebung der Gonade in späten Embryonalstadien erforderlich ist. Dieses Protokoll kann mit pharmakologischen Behandlungen oder transgener Manipulation spezifischer Zelllinien innerhalb der Gonade kombiniert werden. Mit dieser Technik haben wir die Schritte der Stammzellnischenbildung erfolgreich abgebildet17. Dieser bildgebende Ansatz ist daher für das Gebiet der Stammzellbiologie von entscheidender Bedeutung, da er die Visualisierung der Anfangsstadien der Nischenbildung in Echtzeit in seiner natürlichen Umgebung ermöglicht15,17. Während diese Methode für das Gebiet der Stammzellbiologie von Vorteil ist, ist sie zusätzlich anwendbar, um dynamische Prozesse zu visualisieren, die während dieses Entwicklungszeitpunkts in der Gonade auftreten, einschließlich zellulärer Umlagerungen 22, Zelladhäsion2, 12, 23 und Zellmigration23. Dieses Sezierprotokoll wird somit unser Verständnis vieler grundlegender zellbiologischer Prozesse verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der Gonadogenese erfährt die embryonale Gonade und insbesondere die Stammzellnische innerhalb der männlichen Gonade15 schnelle morphologische Veränderungen. Entwicklungsmechanismen, die diesen dynamischen Veränderungen zugrunde liegen, lassen sich am besten durch Live-Imaging-Techniken verstehen. Im embryonalen Stadium 17 wird die In-vivo-Bildgebung der Gonade jedoch durch den Beginn großflächiger Muskelkontraktionenunmöglich gemacht 17. Mit diesem …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Lindsey W. Plasschaert und Justin Sui für ihre wesentlichen Beiträge zur frühen Entwicklung dieses Protokolls. Die Autoren danken der Fliegengemeinschaft für ihre Großzügigkeit mit Reagenzien und insbesondere Ruth Lehmann und Benjamin Lin für ihr Geschenk der Linie nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ vor der Veröffentlichung. In dieser Studie wurden Bestände aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) verwendet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 und R35GM136270 (S.D) sowie Schulungszuschüsse T32GM007229 (B.W.) und F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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