Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía
Summary
Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.
Abstract
La gónada embrionaria masculina de Drosophila melanogaster es un modelo ventajoso para estudiar varios aspectos de la biología del desarrollo, incluidos, entre otros, el desarrollo de células germinales, la biología de piRNA y la formación de nichos. Aquí, presentamos una técnica de disección para obtener imágenes en vivo de la gónada ex vivo durante un período en el que las imágenes en vivo in vivo son altamente ineficaces. Este protocolo describe cómo transferir embriones a un plato de imágenes, elegir embriones masculinos en etapas adecuadas y diseccionar la gónada de su tejido circundante mientras se mantiene su integridad estructural. Después de la disección, las gónadas se pueden obtener imágenes utilizando un microscopio confocal para visualizar los procesos celulares dinámicos. El procedimiento de disección requiere un tiempo y una destreza precisos, pero proporcionamos información sobre cómo prevenir errores comunes y cómo superar estos desafíos. Hasta donde sabemos, este es el primer protocolo de disección para la gónada embrionaria de Drosophila , y permitirá la obtención de imágenes en vivo durante una ventana de tiempo que de otro modo sería inaccesible. Esta técnica se puede combinar con manipulaciones transgénicas farmacológicas o específicas de tipo celular para estudiar cualquier proceso dinámico que ocurra dentro o entre las células en su entorno gonadal natural.
Introduction
El Drosophila melanogaster testis ha servido como paradigma para nuestra comprensión de muchos procesos celulares dinámicos. Los estudios de este modelo han arrojado luz sobre la regulaciónde la división de células madre 1,2,3, el desarrollo de células germinales 4,5, la biología de piRNA 6,7,8 y los eventos de señalización de células madre de nicho 9,10,11,12,13. Este modelo es ventajoso porque es genéticamente tratable14,15 y es uno de los pocos en los que podemos vivir células madre en su entorno natural 3,16,17,18. Sin embargo, la imagen en vivo de este modelo se ha limitado al tejido adulto y a las etapas embrionarias tempranas, dejando un vacío en nuestro conocimiento de la dinámica gonadal en el embrión tardío, la etapa precisa en la que el nicho se está formando por primera vez y comienza a funcionar.
La gónada embrionaria en etapa tardía es una esfera, que consiste en células de nicho somáticas en la parte anterior, y células germinales enquistadas por células gonadales somáticas en las regiones más posteriores19. Este órgano puede ser fotografiado en vivo in vivo hasta la etapa embrionaria temprana 17 17,20,21. Se previenen más imágenes debido al inicio de contracciones musculares a gran escala. Estas contracciones son tan severas que empujan la gónada fuera del marco de la imagen, y tal movimiento no se puede corregir con el software de imágenes. Nuestro laboratorio está interesado en revelar los mecanismos de formación de nichos, que ocurre durante este período difícil de alcanzar para las imágenes en vivo. Por lo tanto, generamos un enfoque ex vivo para obtener imágenes en vivo de la gónada a partir de la etapa embrionaria 16, facilitando el estudio de la dinámica celular durante este período crucial de desarrollo de la gónada. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que esta imagen ex vivo recapitula fielmente el desarrollo de gónadas in vivo 17. Esta técnica es la primera y única de su tipo para la gónada embrionaria de Drosophila.
Aquí, presentamos el protocolo de disección requerido para la obtención de imágenes en vivo ex vivo de la gónada durante las etapas embrionarias tardías. Este protocolo se puede combinar con tratamientos farmacológicos o manipulación transgénica de linajes celulares específicos dentro de la gónada. Usando esta técnica, hemos fotografiado con éxito los pasos de la formación de nichos de células madre17. Este enfoque de imagen es, por lo tanto, instrumental para el campo de la biología de células madre, ya que permitirá la visualización de las etapas iniciales de la formación de nichos en tiempo real dentro de su entorno natural15,17. Si bien este método es beneficioso para el campo de la biología de células madre, también es aplicable para visualizar cualquier proceso dinámico que ocurra en la gónada durante este punto de tiempo de desarrollo, incluidos los reordenamientos celulares22, la adhesión celular 2,12,23 y la migración celular23. Este protocolo de disección mejorará así nuestra comprensión de muchos procesos biológicos celulares fundamentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la gonadogénesis, la gónada embrionaria, y particularmente el nicho de células madre dentro de la gónada masculina15, sufre cambios morfológicos rápidos. Los mecanismos de desarrollo que subyacen a estos cambios dinámicos se entienden mejor a través de técnicas de imágenes en vivo. Sin embargo, en la etapa embrionaria 17, las imágenes in vivo de la gónada se vuelven imposibles por el inicio de contracciones musculares a gran escala17. Con este p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Lindsey W. Plasschaert y Justin Sui por sus contribuciones sustanciales al desarrollo temprano de este protocolo. Los autores agradecen a la comunidad de moscas por su generosidad con los reactivos, y en particular a Ruth Lehmann y Benjamin Lin por su regalo de la línea nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ antes de su publicación. En este estudio se utilizaron las existencias obtenidas del Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Este trabajo fue apoyado por NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 y R35GM136270 (S.D), así como por becas de capacitación T32GM007229 (B.W.) y F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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