Summary
Immunhiistokjemi farging og 16S ribosomal RNA gen (16S rRNA gen) sekvensering ble utført for å oppdage og skille bakterier i kreft og ikke-kreftholdig eggstokkvev in situ. De sammensetningsmessige og funksjonelle forskjellene i bakteriene ble spådd ved å bruke BugBase og Phylogenetic Investigation of Communities ved rekonstruksjon av uobserverte stater (PICRUSt).
Abstract
Teorien om en "steril" kvinnelig øvre reproduktive kanal har møtt økende motstand på grunn av fremskritt innen bakteriedeteksjon. Hvorvidt eggstokkene inneholder bakterier er imidlertid ennå ikke bekreftet. Heri ble et eksperiment for å oppdage bakterier i eggstokkvev introdusert. Vi valgte eggstokkkreftpasienter i kreftgruppen og ikke-kreftpasienter i kontrollgruppen. 16S rRNA gensekvensering ble brukt til å skille bakterier i eggstokkvev fra kreft- og kontrollgruppene. Videre forutsa vi den funksjonelle sammensetningen av de identifiserte bakteriene ved hjelp av BugBase og PICRUSt. Denne metoden kan også brukes i andre viscera og vev siden mange organer har vist seg å huse bakterier de siste årene. Tilstedeværelsen av bakterier i viscera og vev kan hjelpe forskere med å evaluere kreft og normalt vev og kan være til hjelp i behandlingen av kreft.
Introduction
Nylig har et økende antall artikler blitt publisert som beviser eksistensen av bakterier i abdominal solid viscera, som nyre, milt, lever og eggstokk1,2. Geller et al. fant bakterier i bukspyttkjertelsvulster, og disse bakteriene var resistente mot gemcitabine, et kjemoterapeutisk legemiddel2. S. Manfredo Vieira et al. konkluderte med at Enterococcus gallinarum var bærbart for lymfeknuter, lever og milt, og det kunne drive autoimmunitet3.
Siden livmorhalsen spiller en rolle som forsvarer, har bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal, som inneholder livmor, egglederne og eggstokkene, blitt minimalt forsket på. Det er imidlertid etablert noen nye teorier de siste årene. Bakterier kan ha tilgang til livmorhulen under menstruasjonssyklusen på grunn av endringer i mucins4,5. I tillegg bekreftet Zervomanolakis et al. at livmoren, sammen med egglederne, er en peristaltisk pumpe kontrollert av eggstokkenes endokrine system, og dette arrangementet gjør det mulig for bakterier å komme inn i endometrium, egglederne og eggstokkene6.
Den øvre reproduktive kanalen er ikke lenger et mysterium takket være utviklingen av bakterielle deteksjonsmetoder. Verstraelen et al. brukte en strekkodet paired-end sekvenseringsmetode for å oppdage livmorbakterier ved å målrette mot V1-2 hypervariabel region i 16S RNA-genet7. Fang et al. ansatt strekkodet sekvensering hos pasienter med endometrial polypper og avslørte tilstedeværelsen av ulike intrauterin bakterier8. I tillegg, ved å bruke 16S RNA-genet, fant Miles et al. og Chen et al. bakterier i kjønnssystemet til kvinner som hadde gjennomgått salpingo-oophorectomy og hysterektomi, henholdsvis5,9.
Bakterier i tumorvev har fått økende oppmerksomhet de siste årene. Banerjee et al. oppdaget at mikrobiomesignaturen var forskjellig mellom eggstokkkreftpasienter og kontroller10. Etnoxynatronum sibiricum var forbundet med tumorstadium, og Methanosarcina vacuolata kan brukes til å diagnostisere eggstokkkreft11. I tillegg til eggstokkkreft har andre kreftformer, som mage, lunge, prostata, bryst, livmorhals og endometrium, vist seg å være forbundet med bakterier12,13,14,15,16,17,18. Poore et al. foreslo en ny klasse mikrobiell basert onkologidiagnostikk, forutså tidlig kreftscreening19. I denne protokollen undersøkte vi forskjellene mellom kreft og normalt eggstokkvev ved å sammenligne sammensetningen og funksjonen til bakterier i disse to vevene.
Immunhiistokjemi farging og 16S rRNA gensekvensering ble utført for å bekrefte tilstedeværelsen av bakterier i eggstokkene. Forskjellene og predikerte funksjonene til eggstokkbakteriene i kreft og ikke-kreftvev ble studert. Resultatene viste eksistensen av bakterier i eggstokkvev. Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata var relatert til henholdsvis scenen og diagnosen eggstokkkreft. Førtiseks signifikant forskjellige KEGG-veier som var til stede i begge gruppene ble sammenlignet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av Medical Institutional Ethics Committee ved First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (Nei. XJTUIAF2018LSK-139). Informert samtykke ble innhentet fra alle påmeldte pasienter.
1. Kriterier for å gå inn i kreftgruppen og kontrollgruppen
- For kreftgruppen, registrere pasienter som primært er diagnostisert med eggstokkkreft, og etter laparotomi, de er bevist å ha serøs ovariekreft av patologiske funn.
- For kontrollgruppen, registrere pasienter som primært er diagnostisert med livmor myoma eller livmor adenomyosis, uten å presentere noen ovarial tilstand, og som har gjennomgått hysterektomi og salpingo-oophorectomy.
MERK: Denne standarden er ikke klar. Pasienter med sykdommer som ikke påvirker eggstokkene som gjennomgår hysterektomi og salpingo-oophorectomy kan også registreres. - Ekskluder pasienter med ett eller flere av følgende kriterier:
Gravide eller ammende kvinner.
Tar antibiotika 2 måneder før operasjonen.
Å ha feber eller forhøyede inflammatoriske markører.
Å ha betennelse av noe slag.
Etter å ha gjennomgått neoadjuvant kjemoterapi.
2. Samle prøver
- Under operasjonen, plasser de resected eggstokkene i et sterilt rør og legg røret i flytende nitrogen for transport. Unngå å berøre noe annet gjennom hele prosedyren.
- Del eggstokkene i ca. 1 cm tykke vevsprøver med et par nye sterile pinsett under et laminært strømningsskap. Etter separasjon, bevare prøver ved -80 °C.
MERK: Alle prosedyrene for å samle prøver er aseptiske, inkludert separering av eggstokkene.
3. Sekvenser 16S rRNA-genet
- Trekk ut DNA.
- Tilsett 1,2 ml hemming av EX-buffer i et 2 ml sentrifugerør. Tilsett deretter 180-220 mg prøver i røret. La prøven blandes helt (70 °C vannbad i 5 min og deretter virvel i 15 s).
- Sentrifuger røret i 1 min ved 600 x g.
- Plasser 550 μL av supernatanten i et nytt 1,5 ml rør, og sentrifuger i 1 min ved 600 x g.
- Overfør 400 μL av supernatanten med 30 μL proteinase K til et annet 1,5 ml rør.
- Tilsett 400 μL buffer AL og bruk en virvelblander i 15 s.
- Inkuber ved 70 °C i 10 minutter.
- Tilsett 400 μL 96-100% alkohol. Bruk en virvelblander i 15 s.
- Overfør 600 μL blanding til en absorpsjonskolonne og sentrifuge i 1 min ved 13700 g. Bytt ut det nedre røret. Gjenta dette trinnet 11 ganger.
- Tilsett 500 μL buffer AW1, sentrifuge i 1 min ved 13 700 x g, og bytt nedre rør.
- Tilsett 500 μL buffer AW2, sentrifuge i 3 min ved 13 700 x g, og bytt nedre rør.
- Sentrifuge i 3 min ved 13 700 x g.
- Overfør blandingen til et nytt 1,5 ml rør, tilsett 200 μL buffer ATE, inkuber ved romtemperatur i 5 min og sentrifuge i 1 min ved 13 700 x g.
- Kvalitetstesting. Bruk 1% Sepharose gel elektroforese for å teste kvaliteten. Tilsett 400 ng prøve, 120 V, 30 min. Ideelt resultat: DNA-konsentrasjon: ≥ 10 ng/μL, DNA-renhet: A260/A280 = 1,8-2,0, brutto DNA: ≥ 300 ng.
- Klargjør bibliotekene ved hjelp av et 16S metagenomisk sekvenseringssett i henhold til produsentens protokoll.
- Utfør PCR. Kort sagt inneholder hver 25 μL PCR-reaksjon 12,5 ng prøve-DNA som inngang, 12,5 μL 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix og 5 μL av hver primer ved 1 μM.
- Utfør PCR ved hjelp av følgende protokoll: et innledende denatureringstrinn utført ved 95 °C i 3 minutter etterfulgt av 25 sykluser med denaturering (95 °C, 30 s), gløding (55 °C, 30 s) og forlengelse (72 °C, 30 s) og en endelig forlengelse på 5 min ved 72 °C.
- Rydd opp PCR-produktet fra reaksjonsblandingen med magnetiske perler ved hjelp av produsentens instruksjoner.
- Gjenta trinn 3.3.1 og 3.3.2.
- Kvalitetstesting. Se trinn 3.2.
- Gjenta trinn 3.3.3.
- Kvalitetstesting. Bruk 1% Sepharose gel elektroforese for å teste urenhet, et spektrofotometer for å teste renhet, et fluorometer for å teste konsentrasjonen, og et RNA-analysesett for å teste integritet. Følg produsentens protokoll. Normaliser og grupper bibliotekene. deretter sekvens (2 x 300 bp parret leseinnstilling) ved hjelp av 600 syklus V3 standard strømningsceller, produserer ca 100,000 parvis-end 2 x 300 base leser.
MERK: Primersekvensene i full lengde: 16S Amplicon polymerasekjedereaksjon (PCR) Fremoverprimer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] og 16S Amplicon PCR Revers primer: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].
4. Analysere 16S rRNA gensekvenseringsdata
- Filtrer rålesningene for hvert utvalg basert på sekvenseringskvalitet med programvarepakken QIIME 2-20180220.
- Kopier tre filer til katalogen: emp-paired-end-sequences_01
en forward.fastq.gz fil som inneholder fremoversekvensen lyder,
en reverse.fastq.gz fil som inneholder omvendt sekvens leser,
en barcodes.fastq.gz fil som inneholder den tilknyttede strekkoden leser - Henrette
qiime verktøy importere \
--type EMPPairedEndSequences \
--input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
- Kopier tre filer til katalogen: emp-paired-end-sequences_01
- Fjern primeren og adaptersekvensene.
qiime cutadapt trim-paret \
--i-demultiplexed-sekvenser demultiplexed-seqs_02.qza \
--p-front-f GCTACGGGGGG \
--p-front-r GCTACGGGGGG \
--p-feil-rate 0 \
--kvalitet-cutoff 25 \
--o-trimmede sekvenser trimmet-seqs_03.qza \
--detaljert - Forkort sekvensen der begge parkoblede kvaliteter er lavere enn 25. Se ovenfor --quality-cutoff 25
- Analyser sekvenseringsdataene.
- Samle sekvenser for å danne operasjonelle taksonomiske enheter (OTUer) med en likhetskutt på 97%.
qiime vsearch dereplicate-sekvenser \
--i-sekvenser trimmet-seqs_03.qza \
--o-dereplicated-table table_04.qza \
--o-dereplicated-sekvenser rep-seqs_04.qza
qiime vsearch klynge-funksjoner-lukket-referanse \
--i-tabell table_04.qza \
--i-sekvenser rep-seqs_04.qza \
--i-reference-sekvenser 97_otus.qza \
--p-perc-identitet 0,97 \
--o-clustered-table tabell-cr-97.qza \
--o-clustered-sekvenser rep-seqs-cr-97.qza \
--o-uovertruffen-sekvenser uovertruffen-cr-97.qza - For OTUene beregner du den relative overfloden i hver prøve. Overflodsinformasjon er i tabell-cr-97.qza
- Samle sekvenser for å danne operasjonelle taksonomiske enheter (OTUer) med en likhetskutt på 97%.
- Bruk en innfødt bayesiansk klassifiserer, som tar sikte på RDP-opplæringssettet (versjon 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), for å sortere alle sekvensene. Kartlagt taksoninformasjon er i tabell-cr-97.qza
- Innenfor den gitte OTU tilordner du en klassifisering som gjenspeiler den største sammenhengen i sekvensene til OTUer. Juster deretter OTUene. Se tabell-cr-97.qza og rep-seqs-cr-97.qza
- Basert på eksempelgruppeinformasjonen utfører du alfamangfold (inkludert Chao 1-, ACE-, Shannon-, Simpson- og Evenness-indeksene) og den UniFrac-baserte hovedkoordinatanalysen (PCoA).
qiime verktøy eksport \
--input-path tabell-cr-97.qza \
--output-path eksportert-feature-table
tabell for eksportert funksjon
qiime mangfold alfa \
--i-tabell tabell-cr-97.qza \
--p-metrisk observed_otus \
--o-alfa-mangfold observed_otus_vector.qza
qiime mangfold beta \
--i-tabell tabell-cr-97.qza \
--p-metrisk braycurtis \
--o-avstand-matrise unweighted_unifrac_distance_matrix.qza
5. Forutsi bakteriefunksjon
- For å forutsi den relaterte representasjonen av bakteriens egenskaper, bruk BugBase21. Inndata-OTU-tabellen for BugBase klargjøres ved hjelp av følgende kommandoer.
biom konvertere -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
biom konvertere -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU tabell" --to-json
MERK: Prediksjonen er basert på seks fenotypekategorier (Ward et al. upublisert) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Gramfarging, oksygentoleranse, evne til å danne biofilmer, mobilt elementinnhold, patogenitet og oksidativ stresstoleranse. - Forutsi den funksjonelle sammensetningen av en metagenom av PICRUSt med bruk av markørgendata og en database som inneholder referansegenomer22.
make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt - Analyser forskjellene i funksjoner mellom hver gruppe ved hjelp av STAMP23,24. Se sitatene for å bruke programvaren.
6. Data
- Bruk statistisk programvare for å beregne betydningen av funnene. Indikasjonen på statistisk signifikans bør settes som P < 0,05.
- Vurder forskjeller i alder og paritet etter studentens t-test. Vurder forskjeller i menopausal status, historie med hypertensjon og diabetes ved chi-square-testen. Vurder forskjeller i antall ovarial bakteriell taxa ved Mann-Whitney U-testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pasienter
Totalt 16 kvalifiserte pasienter ble inkludert i studien. Kontrollgruppen inkluderte 10 kvinner med en diagnose av godartet livmor svulst (blant dem ble 3 pasienter diagnostisert med livmor myoma, og 7 pasienter ble diagnostisert med livmor adenomyose). I mellomtiden inneholdt kreftgruppen 6 kvinner med en diagnose av serøs eggstokkkreft (blant dem ble 2 pasienter diagnostisert med stadium II, og 2 av dem ble diagnostisert med stadium III). Følgende egenskaper viste ingen forskjeller mellom pasienter i kontrollgruppen og kreftgruppen: alder, menopausal status, paritet, hypertensjonshistorie og diabeteshistorie (tabell 1).
Tabell 1: Pasientstatistikk Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Rikdommen og mangfoldet av eggstokkbakterielle arter i begge gruppene
Tilstedeværelsen av bakterier ved hjelp av immunhiokjemifarging ble vist i figur 1. Mikroberens alfamangfold ble analysert som en metode for å oppdage rikdom og variasjon av eggstokkbakterielle arter. Antall arter observert i eggstokkkreftvevet var mindre enn kontrollgruppens, uten signifikant forskjell. Rikdommen (representert ved Chao 1- og ACE-indeksen) og mangfoldet (representert ved Shannon-, Simpson- og Evenness-indeksen) av bakterieartene var begge ikke signifikant forskjellige mellom kreftgruppen og kontrollgruppen (figur 2).
Figur 2: 16S rRNA gensekvensering viser forskjeller mellom kreft- og kontrollgruppene i bakteriell rikdom og mangfold. (A) Observert artsindeks (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); (B) Chao 1 indeks (P = 0,06, Mann-Whitney U test); (C) ACE-indeks (P = 0,06, Mann-Whitney U-test); (D) Shannon-indeks (P = 0,32, Mann-Whitney U-test; E. Evenness indeks (P = 0,48, Mann-Whitney U test); (F) Simpson-indeks (P = 0,46, Mann-Whitney U-test). Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Beskrivelse av eggstokkbakterier
Dyp sekvensering av V3-V4 16S rRNA genregionen ble utført på alle prøver for å få en bedre forståelse av eggstokkbakteriene. Resultatene viste at Proteobacteria var den mest tallrike fylumen (67,10% i kontrollgruppen og 67,20% i kreftgruppen), Firmicutes var den nest mest tallrike fylumen (23,20% 77% i kontrollgruppen og 23,82% i kreftgruppen), og den tredje mest tallrike phylum var bakteroideter (3,26% i kontrollgruppen og 3,41% i kreftgruppen). Ved analyse av arter i kontrollgruppen besto hovedsammensetningen av Halobacteroides halobios (14,53%), etterfulgt av Gemmata obscuriglobus (11,07%) og Methyloprofundus sedimenti (10,69%). For kreftgruppen var Gemmata obscuriglobus den rikeste i klyngen (13,89 %), etterfulgt av Halobacteroides halobius (11,99 %) og Methyloprofundus sedimenti (11,12 %) (figur 3).
Figur 3: Relativ overflod av phyla (> 1%) og av de 12 beste artene i eggstokkprøver. (A) Den relative overflod av phyla (> 1%) i eggstokkene til pasientene i kontrollgruppen. (B) Den relative overflod av phyla (> 1%) i eggstokkene til pasienter med eggstokkkreft. (C) De relative overflodene av de 12 mest tallrike bakterieartene i eggstokkene til kontrollpasientene. (D) De relative overflodene av de 12 mest tallrike bakteriearter i eggstokkene til eggstokkkreftpasienter. Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ulike sammensetninger av eggstokkbakterier mellom de to gruppene
En sammenligning av forskjellige bakteriesamfunn ble utført av PCoA ved hjelp av PERMANOVA. Resultatene viste at bakteriene i kontrollgruppen skilte seg fra de i kreftgruppen, P < 0,05 (figur 4).
Figur 4: PCoA oppdager klynger av samfunn og de relative overflodene av Anoxynatronum sibiricum og Methanosarcina vacuolata. (A) Communities ble gruppert ved hjelp av PCoA. PC1 og PC2 er plottet på x- og y-aksene. Den røde blokken indikerer en prøve i ovariekreftgruppen. Den blå sirkelen angir en prøve i kontrollgruppen. Prøvene fra ovariekreftgruppen ble skilt fra andre prøver i kontrollgruppen. (B) Samfunn gruppert ved hjelp av PCoA. PC1 og PC2 er plottet på x- og y-aksene. Den røde blokken indikerer en prøve i ovariekreftgruppen. Den blå faste sirkelen indikerer en prøve fra en pasient med livmor myoma, og den blå hule sirkelen er lik en prøve av en pasient med livmoradenomyose. (C) Den relative overflod av Anoxynatronum sibiricum (kontrollgruppe: n = 10, kreftgruppe: n = 6, P = 0,034, Mann-Whitney U test). (D) Den relative overflod av Methanosarcina vacuolata (kontrollgruppe: n = 10, kreftgruppe: n = 6, P = 0,001, Mann-Whitney U test). Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ovariebakteriell sammensetning i kreft- og kontrollgrupper fra ulike perspektiver
En analyse av eggstokkbakteriell sammensetning ble utført fra forskjellige perspektiver for å ytterligere oppdage forskjellene i de identifiserte eggstokkbakteriene. I tabell 2ble fylum, klasse, orden, familie, slekt og artsnivåer vurdert, og statistikk er gitt i diagrammet. Spesielt var det en sammenheng mellom den relative overfloden av Anoxynatronum sibiricum og svulststadiet, og Methanosarcina vacuolata var et spesifikt tegn når man diagnostiserte eggstokkkreft (tabell 2).
Fenotypisk bevaring av eggstokkbakterier i de to gruppene basert på predikerte funksjoner
I kreftgruppen ble uttrykket av gener relatert til potensielt patogene og oksidative stresstolerante fenotyper økt sammenlignet med kontrollgruppen (Wilcoxon signed-rank test, P =0,02 og P =0,002). Ingen signifikant forskjell ble funnet mellom eggstokkkreft og kontrollgrupper i følgende aspekter: fenotypene av aerobe, anaerobe, fakultets anaerobe, gram-positive og gram-negative bakterier; mobile elementer; biofilmdannelse av ovariebakteriene (figur 5). Førtiseks variant KEGG-veier mellom bakteriene i eggstokkene i kreft- og kontrollgruppene ble bestemt. Eggstokkene i kreftgruppen viste 26 økte veier. Blant dem var de mest relaterte veiene transportører. På den annen side viste bakteriene i eggstokkkreftvev 20 reduserte veier. De mest relevante funksjonene var som følger: sekresjonssystem, ukjente funksjoner og tokomponentsystem. Resten av stiene vises i figur 6.
Figur 1: LPS immunhiistokjemisk uttrykk i eggstokkene. (A) Kontrollgruppe (10 x). Skalastenger, 200 μm. (B) Kontrollgruppe (40 x). Skalastenger, 50 μm. (C) Kreftgruppe (10x). Skalastenger, 200 μm. (D) Kreftgruppe (40 x). Skalastenger, 50 μm. Piler peker på LPS-farging i eggstokkvevet. Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Predikerte metagenomer analysert av BugBase. Uttrykket av noen gener i kreftgruppen ble økt sammenlignet med det i kontrollgruppen. Disse genene var relatert til potensielt patogene (Wilcoxon signert-rank test, P = 0,02) og oksidative stress-tolerante fenotyper av eggstokkene. (Wilcoxon signert-rank test, P = 0,002). Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: PICRUStanalyse av ulike KEGG-veier mellom kreft- og kontrollgruppene. Vi fikk tillatelse til å skrive ut på nytt fra tidligere utgivere. Denne figuren er endret fra Wang et al.11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 2: Rikdom (representert ved Chao 1- og ACE-indeksen) og mangfoldet (representert ved Shannon-, Simpson- og Evenness-indeksen) av bakterieartene Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovariekreft har en bemerkelsesverdig innflytelse på kvinners fruktbarhet25. De fleste eggstokkkreftpasienter diagnostiseres på sene stadier, og 5-års overlevelsesrate er mindre enn 30%18. Bekreftelse av bakterier i abdominal solid viscera, inkludert leveren, bukspyttkjertelen og milten, har blitt publisert. Eksistensen av bakterier i øvre kvinnelige reproduktive kanal oppstår fordi livmorhalsen ikke er vedlagt2,3,4,5. Men om eggstokkene, som er abdominal solid viscera, er sterile eller ikke, er ennå ikke bestemt. I tillegg er om bakterier i eggstokkene er relatert til eggstokkkreft også et viktig spørsmål.
De signifikante forskjellene i bakteriene vi fant ble sammenlignet mellom ulike grupper. Alle prosedyrene nevnt ovenfor var strengt bakteriefrie, inkludert instrumenter, reagenser, utstyr og driften av hele protokollen. Enda viktigere er at vi brukte eggstokkene fra pasienter med godartet livmorsykdom som kontrollgruppe for å motvirke mulig forurensning. I denne protokollen kan imidlertid forurensning ikke unngås. Således, siden kreftgruppen og kontrollgruppen ble analysert i samme eksperimentelle miljø, bare ved å sammenligne forskjellene mellom disse to gruppene, kunne vi få primære bevis om den mikrobiologiske opprinnelsen til eggstokkkreft.
Funnene av bakterier i eggstokkvev kan starte et nytt felt som undersøker bakteriene som påvirker eggstokkkreft. I tillegg kan den unike tilstedeværelsen og sammensetningen av bakterier i kreftholdig eggstokkvev lede kreftfremkallende kreft, og de terapeutiske og prognostiske målene for bakterier. Blant de 46 KEGG-veiene vakte funksjoner relatert til biosyntesen av vancomycingruppe antibiotika spesiell oppmerksomhet. Dette kan gi ytterligere behandlingsalternativer for eggstokkkreft.
Protokollen hadde imidlertid noen begrensninger. For det første kunne ikke prøvene samles inn fra friske mennesker av etiske årsaker. Kontrollgruppen var eggstokkene til pasienter med godartet livmorsykdom (inkludert livmor myoma og adenomyose). For det andre bør antall prøver være større. Den begrensede utvalgsstørrelsen på studien kan hemme nøyaktigheten av resultatene. For det tredje, selv om kreftgruppen og kontrollgruppen var under samme tilstand, var det ingen negative eller positive kontroller. I tillegg kunne forurensning ikke unngås. Til dags dato er studien av eggstokkbakteriene hos pasienter med eggstokkkreft fortsatt i et tidlig stadium. En større studie med flere prøver er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Clinical Research Award of the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, China (XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), Major Basic Research Project of Natural Science of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2018JM7073, 2017ZDJC-11), det viktigste forsknings- og utviklingsprosjektet til Shaanxi Provincial Science and Technology Department (2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), Shaanxi Provincial Collaborative Technology Innovation Project (2 017XT-026, 2018XT-002) og Det medisinske forskningsprosjektet til Xi'an Social Development Guidance Plan (2017117SF/YX011-3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.
Vi takker kollegene ved Institutt for gynekologi ved First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University for deres bidrag til å samle inn prøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2200 TapeStation Software | Agilgent United States |
||
| AmpliSeq for Illumina Library Prep, Indexes, and Accessories | Illumina | ||
| Image-pro plus 7 | Media Cybernetics | ||
| Leica ASP 300S | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica EG 1150 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| Leica RM2235 | Leica Biosystems Division of Leica Microsystems | ||
| LPS Core monoclonal antibody, clone WN1 222-5 | Hycult Biotech | ||
| Mag-Bind RxnPure Plus magnetic beads | Omega Biotek | M1386-00 | |
| Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit | Omega Biotek | M4029-01 | |
| MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | |
| Silva database | Max Planck Institute for Marine Microbiology and Jacobs University | ||
| the QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | |
| Trimmomatic | Björn Usadel | ||
| ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit | Zytomed Systems | HRP008DAB-RB |
References
- Manfredo Vieira, S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Geller, L. T., et al. Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine. Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).
- Manfredo, V. S., et al. Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans. Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).
- Brunelli, R., et al. Globular structure of human ovulatory cervical mucus. FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).
- Chen, C., et al. The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases. Nature Communications. 8 (1), 875 (2017).
- Zervomanolakis, I., et al. Physiology of upward transport in the human female genital tract. Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).
- Verstraelen, H., et al. Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene. PeerJ. 4, 1602 (2016).
- Fang, R. L., et al. Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps. American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).
- Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy. Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).
- Banerjee, S., et al.
- Wang, Q., et al. The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ. Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8 (2020).
- Wang, L., et al. Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).
- Hosgood, H. D., et al. The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures. Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).
- Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing. Cancers. 11 (3), 309 (2019).
- Urbaniak, C., et al. The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer. Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).
- Feng, Y., et al. Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer. BMC Genomics. 20 (1), 146 (2019).
- Walsh, D. M., et al. Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome). Scientific Reports. 9 (1), 19213 (2019).
- Walther-Antonio, M. R., et al. Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer. Genome Medicine. 8 (1), 122 (2016).
- Poore, G. D., et al. Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach. Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Ward, T., et al. BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes. bioRxiv. , (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
- Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814 (2013).
- Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinformatics. 30 (21), 3123 (2014).
- Leranth, C., Hamori, J. 34;Dark" Purkinje cells of the cerebellar cortex. Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).
