Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية الحشوية البشرية المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي والتنميط الظاهري للبلاعم

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61884
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 6, 2, 7, 8
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لهضم الكولاجين لعزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وخلايا جزء الأوعية الدموية اللحمية من الدهون الحشوية البشرية في عملية واحدة ، بما في ذلك منهجية الحصول على الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الخلايا الشحمية والتنميط الظاهري لبلاعم SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Abstract

الأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) هي عضو استقلابي نشط يتكون أساسا من الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا الجزء الوعائي اللحمي (SVF) ، والتي تطلق جزيئات نشطة بيولوجيا مختلفة تتحكم في العمليات الأيضية والهرمونية والمناعية. حاليا ، من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العمليات داخل الأنسجة الدهنية. لذلك ، فإن تطوير طرق تقييم مساهمة كل مجموعة خلايا في الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول خطوات العزل ويوفر إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها اللازمة للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة و SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم تحسين البروتوكول أيضا لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم وإجراء عزل الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة لدراسات التعبير الجيني ، مما يسمح بإجراء دراسات تشريح التفاعل بين مجموعات الخلايا هذه. باختصار ، يتم غسل خزعات ضريبة القيمة المضافة ، وفرمها ميكانيكيا ، وهضمها لتوليد تعليق أحادي الخلية. بعد الطرد المركزي ، يتم عزل الخلايا الشحمية الناضجة عن طريق التعويم من حبيبات SVF. يضمن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية من إجمالي الحمض النووي الريبي (بما في ذلك miRNAs) من الخلايا الشحمية لمقايسات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، يتم استخدام خلايا SVF لتوصيف مجموعات فرعية من البلاعم (النمط الظاهري المؤيد والمضاد للالتهابات) من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

Introduction

لا تتكون الأنسجة الدهنية البيضاء من الخلايا الدهنية أو الخلايا الشحمية فحسب ، بل تتكون أيضا من جزء من الخلايا غير الدهنية يعرف باسم جزء الأوعية الدموية اللحمية (SVF) ، والذي يحتوي على مجموعة خلايا غير متجانسة تتكون من الضامة ، والخلايا المناعية الأخرى كخلايا تائية تنظيمية (Tregs) ، وحمضات ، وخلايا preadipocytes ، وخلايا ليفية ، محاطة بأنسجة وعائية وضامة 1,2. تعتبر الأنسجة الدهنية (AT) الآن عضوا ينظم العمليات الفسيولوجية المتعلقة بالتمثيل الغذائي والالتهاب من خلال الأديبوكينات والسيتوكينات والحمض النووي الريبي الدقيق الذي تنتجه وتطلقه خلايا مختلفة في الأنسجة ، مع تأثيرات autocrine و paracrine والغدد الصماء 3,4. في البشر ، تشتمل الأنسجة الدهنية البيضاء على الأنسجة الدهنية تحت الجلد (SAT) والأنسجة الدهنية الحشوية (VAT) ، مع اختلافات تشريحية وجزيئية وخلوية وفسيولوجية مهمة بينهما 2,5. يمثل SAT ما يصل إلى 80٪ من ATالبشري ، بينما تقع ضريبة القيمة المضافة داخل تجويف البطن ، بشكل رئيسي في المساريق والثرب ، كونها أكثر نشاطا من الناحية الأيضية6. علاوة على ذلك ، فإن ضريبة القيمة المضافة هي عضو في الغدد الصماء يفرز وسطاء لهم تأثير كبير على وزن الجسم وحساسية الأنسولين واستقلاب الدهون والالتهابات. وبالتالي ، يؤدي تراكم ضريبة القيمة المضافة إلى السمنة في منطقة البطن والأمراض المرتبطة بالسمنة مثل مرض السكري من النوع 2 ، ومتلازمة التمثيل الغذائي ، وارتفاع ضغط الدم ، ومخاطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية ، مما يمثل مؤشرا أفضل للوفيات المرتبطة بالسمنة6،7،8،9.

في ظروف الاستتباب ، تتعاون الخلايا الشحمية والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى للحفاظ على استقلاب ضريبة القيمة المضافة من خلال إفراز وسطاء مضادين للالتهابات10. ومع ذلك ، فإن التوسع المفرط في ضريبة القيمة المضافة يعزز تجنيد الخلايا التائية المنشطة والخلايا القاتلة الطبيعية والبلاعم. في الواقع ، في ضريبة القيمة المضافة الخالية من الدهون ، تبلغ نسبة البلاعم 5٪ ، بينما ترتفع هذه النسبة إلى 50٪ في السمنة ، مع استقطاب البلاعم من النمط الظاهري المضاد للالتهابات إلى النمط الظاهري المؤيد للالتهابات ، مما يولد بيئة التهابية مزمنة10,11.

نتيجة لوباء السمنة ، نشأ عدد مذهل من التقارير التي تتناول مواضيع بحثية مختلفة لضريبة القيمة المضافة ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الدهنية ، وعلم التخلق ، والالتهابات ، وخصائص الغدد الصماء ، والمناطق الناشئة مثل الحويصلات خارج الخلية ، من بين أمور أخرى8،10،12،13. ومع ذلك ، على الرغم من أن بيئة ضريبة القيمة المضافة يتم تعريفها من خلال الحديث المتبادل بين الخلايا الشحمية والبلاعم المقيمة أو القادمة ، فقد ركزت معظم الدراسات على مجموعة خلايا واحدة فقط ، وهناك معلومات نادرة حول تفاعل هذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة وعواقبها الفسيولوجية المرضية11,14. علاوة على ذلك ، تم إجراء دراسات قيمة تتناول تفاعل الخلايا الشحمية والبلاعم في AT باستخدام خطوط الخلايا ، وتفتقر إلى ظروف التحضير في الجسم الحي 11،14،15. تتطلب الإستراتيجية المناسبة لتشريح التفاعل أو المساهمة الخاصة لهذه الخلايا في ضريبة القيمة المضافة عزل كلا النوعين من الخلايا عن نفس خزعة الدهون لإجراء فحوصات في المختبر تعكس قدر الإمكان الخصائص في الجسم الحي التي تنظم عملية التمثيل الغذائي لضريبة القيمة المضافة.

على الرغم من أن طرق التفكك غير الأنزيمية القائمة على القوى الميكانيكية لكسر AT تضمن الحد الأدنى من التلاعب ، إلا أنه لا يمكن استخدام هذه الطرق إذا كان الهدف هو دراسة خلايا SVF ، حيث تتمتع بكفاءة أقل في استعادة الخلايا وقابلية بقاء منخفضة للخلايا مقارنة بالطرق الأنزيمية ، وهناك حاجة إلى حجم أكبر من الأنسجة 16,17. الهضم الأنزيمي باستخدام كولاجيناز هو طريقة لطيفة تسمح بالهضم الكافي للكولاجين وبروتينات المصفوفة خارج الخلية للأنسجة الليفية مثل WAT18 وكثيرا ما يستخدم عندما يكون التربسين غير فعال أو ضار19. يوفر البروتوكول إرشادات أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها للعزل الفعال للخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة البشرية في عملية واحدة ، باستخدام تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز ، مما يعطي معلومات لضمان غلة عالية (الكمية والنقاء والسلامة) من إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة ، بما في ذلك microRNAs ، لتطبيقات التعبير النهائية. في الوقت نفسه ، تم تحسين البروتوكول لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم من خلايا SVF من خلال تلطيخ علامات متعددة مرتبطة بالغشاء لمزيد من التحليل بواسطة قياس التدفقالخلوي 20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل IRB التابع للمعهد الوطني للمحيطات (212250-3210-21002-06-15). وكانت المشاركة طوعية، ووقعت جميع النساء المسجلات على استمارة الموافقة المستنيرة.

1. جمع الأنسجة الدهنية الحشوية

  1. الحصول على خزعات ضريبة القيمة المضافة من خلال استئصال الثرب الجزئي أثناء العملية القيصرية من النساء البالغات الأصحاء مع الحمل الفردي في فترة الحمل دون مخاض.
  2. بعد إغلاق الرحم والإرقاء ، تابع تحديد الثرب الأكبر وتمديده على ضغط رطب. التكنولوجيا المساعدة المكشوفة هي ضريبة القيمة المضافة.
  3. حدد موقع أكبر وعاء دموي وتتبع خطا وهميا من 7 × 5 سم إلى قاعدة الثرب الأكبر.
  4. حدد منطقة الأوعية الدموية واستخدم ملقط كيلي لحفر الجانب الخارجي من ضريبة القيمة المضافة.
  5. استخدم ملقط Ochsner لتثبيت الجانب القريب والبعيد في المنطقة التي تم فيها حفر ضريبة القيمة المضافة واستخدم مقص Metzenbaum لقطع الأنسجة.
  6. اربط الثرب الأكبر بالحرير الأسود رقم 1.
  7. إزالة ملقط Ochsner وتقييم الارقاء.
  8. ضع خزعة ضريبة القيمة المضافة في حاوية معقمة وانقلها إلى المختبر على الفور.

2. الهضم الأنزيمي للأنسجة الدهنية الحشوية وعزل الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا الكسر الوعائي اللحمي

  1. قم بوزن خزعة ضريبة القيمة المضافة واشطفها باستخدام 1x PBS pH 7.4.
  2. قطع 4 غرام من ضريبة القيمة المضافة واستخدام مقص لفرم الأنسجة إلى قطع صغيرة في صينية تشريح.
  3. انقل ضريبة القيمة المضافة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل ، وأضف 20 مل من برنامج تلفزيوني ، ورج برفق لإزالة فائض خلايا الدم الحمراء.
  4. تجاهل برنامج تلفزيوني وكرر الإجراء مرتين.
  5. نقل ضريبة القيمة المضافة إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 50 مل وإضافة 25 مل من محلول الهضم (0.25٪ كولاجيناز من النوع الثاني ، 5 مللي متر جلوكوز ، 1.5٪ ألبومين في برنامج تلفزيوني).
  6. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في شاكر مداري عند 125 دورة في الدقيقة.
  7. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال ثلاث طبقات من الشاش في أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 50 مل.
  8. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  9. يتم الحصول على مرحلتين ، مرحلة عليا تتوافق مع الخلايا الشحمية الناضجة ، بينما تبقى خلايا SFV في الحبيبات. انقل الخلايا الشحمية الناضجة برفق إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة نقل.
  10. أضف 20 مل من برنامج تلفزيوني بارد ، رجه برفق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل برنامج تلفزيوني وكرر الإجراء مرتين.
  12. استخدم ماصة نقل لنقل الخلايا الشحمية الناضجة برفق إلى أنبوب طرد مركزي خال من DNase-RNase سعة 1.5 مل.
  13. أجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة PBS الزائد باستخدام ماصة P200 الدقيقة. كرر هذه الخطوة إذا لزم الأمر.
  14. انقل بلطف 300 ميكرولتر من معلق الخلايا الشحمية الناضجة إلى أنابيب طرد مركزي خالية من DNase-RNase سعة 1.5 مل. قم بتخزين الخلايا الشحمية الناضجة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: الخلايا الشحمية لا تشكل حبيبات.
  15. بمجرد فصل الخلايا الشحمية (الخطوة 2.9) ، قم بنضح معظم محلول الهضم باستخدام ماصة نقل ، مع الحفاظ على حبيبات SVF في قاع الأنبوب.
  16. انقل الحبيبات بخلايا SVF إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة نقل.
  17. اغسل حبيبات الخلايا برفق ، مع تعليقها في 20 مل من البرد 1x PBS عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  18. أجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية والتخلص بسرعة من المادة الطافية عن طريق الصب.
  19. قم بإجراء غسل ثان بتكرار الخطوتين 2.17 و 2.18.
  20. أضف 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء المتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT) إلى حبيبات SVF وقم بتعليقها عن طريق السحب المتكرر. لا دوامة.
  21. احتضان لمدة 5 دقائق في RT وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 800 × غرام. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة نقل وتخلص منها بشكل صحيح.
  22. لتحييد المخزن المؤقت للتحلل ، أضف 10 مل من 1x PBS البارد واخلطه برفق حتى تتفكك حبيبات الخلية.
  23. أجهزة طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق للحصول على حبيبات SVF والتخلص من PBS. يجب أن تكون الحبيبات البيضاء مرئية في أسفل الأنبوب.
  24. أعد تعليق الخلايا في 5 مل من 1x PBS في RT عن طريق السحب المتكرر وتصفيتها من خلال ثلاث طبقات من الشاش في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. بعد ذلك ، سيتم استخدام هذه الخلايا لتوصيف المجموعات الفرعية للبلاعم عن طريق قياس التدفق الخلوي.

3. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة

  1. قم بإعداد منطقة نظيفة باستخدام رذاذ إزالة التلوث RNase لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. استخدم مجموعة من الماصات المخصصة لإجراءات الحمض النووي الريبي. يجب أن تكون جميع الأنابيب والنصائح المستخدمة خالية من RNase.
  2. قم بإذابة معلق الخلايا الشحمية الناضجة (القسم 2.14) عند 4 درجات مئوية إذا تم تخزينه إلى -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.
  3. خلايا التحلل عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من الكاشف القائم على حمض جوانيدينيوم الفينول ، وتخلط جيدا مع ماصة P1000 الدقيقة للتجانس.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق في RT لتعزيز تفكك مجمعات البروتين النووي.
  5. خلية الطرد المركزي تحلل لمدة 5 دقائق عند 12000 × جم في RT. سيتم الحصول على ثلاث مراحل: المرحلة العليا (الصفراء) المقابلة لدهون الخلايا الشحمية ، والمرحلة الوسطى (الوردي) المقابلة للأحماض النووية ، والحبيبات (الحطام الخلوي).
  6. قم بإزالة طبقة الدهون بعناية باستخدام ماصة P200.
  7. نقل المرحلة الوسطى إلى أنبوب جديد 2 مل ، وتجنب بقايا الدهون والحبيبات المزعجة (حوالي 700 ميكرولتر).

4. تنقية الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك microRNAs

ملاحظة: يتم استخدام طريقة تنقية الحمض النووي الريبي الكلي القائمة على العمود للحصول على إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة.

  1. أضف حجما مساويا من الإيثانول (95٪ -100٪) إلى العينة من القسم 3.7 ، حوالي 700 ميكرولتر ، واخلطه يدويا مع قلب الأنبوب لمدة 10 ثوان.
  2. نقل 700 ميكرولتر من الخليط إلى عمود يتم إدخاله في أنبوب تجميع وأجهزة طرد مركزي وتجاهل التدفق.
  3. أعد تحميل العمود وكرر الخطوة 4.2.
  4. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد.
  5. أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت قبل الغسيل إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي. تجاهل التدفق وكرر هذه الخطوة.
  6. أضف 700 ميكرولتر من محلول الغسيل إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة.
  7. انقل العمود بعناية إلى أنبوب خال من النيوكلياز.
  8. أضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز مباشرة إلى مصفوفة العمود وقم بإزالة الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي. تحضير حصص 10 ميكرولتر باستخدام أنابيب ميكروفوج 200 ميكرولتر.
  9. ضع القسمة على الفور على الجليد واستخدم أحدها لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته.
  10. قم بإعداد حصة 5 ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي المعدل إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر لقياس سلامة الحمض النووي الريبي وتركيز الحمض النووي الريبي الدقيق.
  11. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

5. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة ونقاوتها وسلامتها ؛ مقايسة قياس كمية الحمض النووي الريبي الميكروي

ملاحظة: يتم إجراء تحديد تركيز الحمض النووي الريبي ونقاوته باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية. يتم إجراء سلامة الحمض النووي الريبي والقياس الكمي miRNA باستخدام محلل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي.

  1. اغسل قارئ العينة بماء جزيئي وامسحه.
  2. قم بتحميل 2 ميكرولتر من ماء الشطف (فارغ) ، وقم بتغيير الإعداد إلى الحمض النووي الريبي ، وانقر فوق الزر فارغ .
  3. قم بتحميل 2 ميكرولتر من العينة وانقر على زر القياس .
  4. بعد اكتمال القراءة ، سجل نسب A260 / A280 و A260 / A230 بالإضافة إلى كمية الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر) (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يعتبر الحمض النووي الريبي مع نسبة OD260 / OD280 و OD260 / OD230 حوالي 2.0 نقيا.
  5. قم بقياس رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستخدام مجموعة سلامة الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: RIN = 10 يتوافق مع الحمض النووي الريبي السليم ، بينما يشير RIN ≤ 3.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور بشدة. بالنسبة للمصفوفات الدقيقة للتعبير أو RT-qPCR ، استخدم الحمض النووي الريبي مع RIN ≥ 6.0.
  6. استخدم مجموعة صغيرة من الحمض النووي الريبي لتحديد تركيز ونسبة الحمض النووي الريبي الصغير ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (الشكل 1C).
    ملاحظة: لتجنب المبالغة في تقدير الحمض النووي الريبي الصغير والمتناهي الصغر ، استخدم عينات الحمض النووي الريبي مع RIN ≥ 6.0.

6. عدد وصلاحية خلايا الكسر الوعائي اللحمي

  1. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من تعليق خلية SVF (القسم 2.24) إلى 90 ميكرولتر من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪ (التخفيف النهائي 1:10) وقم بتطبيق 10 ميكرولتر على مقياس الدم القياسي.
  2. عد الخلايا القابلة للحياة بعناية، باستثناء الخلايا الميتة، في أربعة مربعات في زاوية غرفة العد.
  3. أوجد تركيز الخلية الموجود في التعليق الأصلي: تركيز الخلية = إجمالي عدد الخلايا / 4 × عامل التخفيف (10) × 10000 = الخلايا / مل
  4. لحساب العائد الخلوي (الخلايا لكل جرام من الأنسجة) التي تم الحصول عليها ، اضرب التركيز الخلوي في إجمالي حجم العينة الأصلي (بالمل) واقسم على وزن الأنسجة المهضومة (بالجرام).
  5. قم بتقييم صلاحية الخلية كنسبة مئوية للخلايا الحية على النحو التالي: ٪ الصلاحية = (عدد الخلايا القابلة للحياة / إجمالي عدد الخلايا) × 100.

7. توصيف مجموعات فرعية من البلاعم من جزء الأوعية الدموية اللحمية

  1. نقل ما مجموعه 1 × 106 خلايا SVF / مل إلى أنبوب اختبار بولي بروبيلين مستدير القاع سعة 5 مل لقياس التدفق الخلوي وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. دوامة بعناية لتخفيف بيليه وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS في RT.
  3. إضافة التركيز الأمثل المعاير مسبقا لكل جسم مضاد أحادي النسيلة مقترن بالفلوروكروم خاص بمستضد سطح الخلية ؛ تخلط بلطف وتحتضن لمدة 15 دقيقة في الظلام في RT.
  4. أضف فائضا من 1x PBS البارد (≈ 1 مل) وأجهزة الطرد المركزي SVF عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. تخلص من المواد الطافية بسرعة عن طريق الصب. احرص على عدم إزعاج الحبيبات.
  6. أضف 500 ميكرولتر من محلول التحلل 1x واحتضان 15 دقيقة في RT ، لحماية الأنابيب من الضوء المباشر.
  7. قم بإزالة المحلول بعد الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واحفظه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية في الظلام حتى الحصول على البيانات.
  8. دوامة الخلايا بدقة بسرعة منخفضة لتقليل التجميع قبل اكتسابها.
  9. أعد تعليق حبيبات SVF في 5 مل من سائل الغمد في RT ، ثم قم بالتصفية عبر ثلاث طبقات من الشاش إلى أنبوب اختبار بولي بروبيلين جديد مستدير القاع سعة 5 مل قبل التحليل بواسطة قياس التدفق الخلوي ، لتقليل انسداد خطوط فرز الخلايا.
  10. دوامة كل أنبوب لفترة وجيزة قبل التحليل.
  11. الحصول على البيانات من العينات ذات الأهمية. لتحليل التدفق ، احسب ما لا يقل عن 10000 حدث.
    ملاحظة: في حالة استخدام مقياس تدفق تدفق فرز الخلايا ، افصل البلاعم للتطبيق في الدراسات اللاحقة.

8. استراتيجية البوابات

  1. ارسم الارتفاع أو العرض مقابل منطقة التشتت الأمامي (FSC) لتحديد المحتوى الفردي (الشكل 2 أ).
  2. حدد الخلايا التي ترسم المنطقة للتشتت الجانبي (SSC) مقابل FSC ، متجاهلة الحطام الخلوي (الشكل 2B).
  3. من الخلايا المختارة ، حدد السكان الذين يعبرون عن CD45 كخلايا مكونة للدم (الشكل 2C) ، والخلايا الإيجابية المزدوجة CD45 / CD14 كبلاعم (الشكل 2D).
  4. من الضامة CD45 + / CD14 + ، اكتشف خلايا HLA-DR السلبية والإيجابية (الشكل 2E).
    ملاحظة: قم بتضمين عناصر التحكم في التعويض للوحة الأجسام المضادة واضبط التداخل الطيفي على مقياس التدفق الخلوي متعدد الألوان المناسب للوحة. نقوم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام مقياس خلوي مجهز بثلاثة أنواع ليزر (ليزر بنفسجي 405 نانومتر ، ليزر أزرق 488 نانومتر ، وليزر أحمر 640 نانومتر) ، وكاشفات للفلوروكرومات المشار إليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول طريقة إنزيمية باستخدام هضم الكولاجيناز متبوعا بالطرد المركزي التفاضلي لعزل الخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF من خزعات ضريبة القيمة المضافة التي تم الحصول عليها من النساء الحوامل الأصحاء بعد استئصال الثرب الجزئي في عملية واحدة. في هذه الحالة ، نستخدم الخلايا الشحمية لاستخراج الحمض النووي الريبي و SVF للتنميط الظاهري للبلاعم.

مكن بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي من الحصول على الحمض النووي الريبي بسلامة عالية نقاء كافية ، و microRNAs من الخلايا الشحمية الناضجة (الشكل 1). أدت سلامة الحمض النووي الريبي التي تم تقييمها بواسطة محلل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي إلى قيم ممتازة لعينات الخلايا الشحمية المعزولة بالبروتوكول (RIN = 9.7).

كان إجمالي الخلايا النواة الموجودة في VAT-SVF حوالي 2.8 × 106 خلايا / جرام من ضريبة القيمة المضافة (2.8 × 106 ± 1.7 × 106) ، مع قابلية بقاء 64٪ (63.9 ± 2.0) باستخدام اختبار استبعاد التريبان الأزرق. تم تصنيف خلايا SVF بأجسام مضادة أولية مترافقة بالفلوروفور لتحديد وتوصيف البلاعم AT عن طريق تحليل فرز الخلايا المنشط بالفلور. يولد تحليل قياس التدفق الخلوي مخططات تظهر مجموعات مختلفة من الخلايا بناء على العلامات الخلوية (الشكل 2). في البداية ، من خلال رسم منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) مقابل ارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) ، تم التخلص من مجاميع الخلايا بسهولة من التحليل (الشكل 2A). بعد ذلك ، تم استبعاد الحطام الخلوي عن طريق بوابات الخلايا بناء على الحجم الصحيح والتعقيد باستخدام منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبية (SSC-A) (الشكل 2B). بعد ذلك ، لتحليل الضامة ، لم يكن من الضروري استبعاد الخلايا المناعية الأخرى. أولا ، تم اختيار خلايا نسب الخلايا الوحيدة / البلاعم باستخدام علامات CD45 و CD14 (الشكل 2C ، D). بعد ذلك ، تم فصل الخلايا الإيجابية المزدوجة CD45 / CD14 بناء على تعبير علامة البلاعم HLA-DR ، حيث تم تحديد مجموعتين فرعيتين من البلاعم: HLA-DR- و HLA-DR + (الشكل 2E).

Figure 1
الشكل 1: مراقبة جودة الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الخلايا الشحمية الناضجة. (أ) تركيز الحمض النووي الريبوزي (RNA)، ونسبة 260/280، و260/230؛ (ب) تحليل النزاهة. تم الحصول على مخطط كهربية وصورة هلام ورقم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي ومجموعة محلل الحمض النووي الريبي. ج: تحديد كمية الحمض النووي الريبوزي الميكروي. تم الحصول على مخطط كهربية ، صورة هلام ، ونسبة microRNA باستخدام محلل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي ومجموعة صغيرة من الحمض النووي الريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعرف على البلاعم من الأنسجة الدهنية الحشوية. مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلي لبلاعم جزء الأوعية الدموية اللحمية المعزولة من الأنسجة الدهنية الحشوية التي تم جمعها أثناء العملية القيصرية باستخدام هضم الكولاجيناز. (أ) تحديد المفردات باستخدام بوابة منطقة التشتت الأمامية الأولى (FSC-A) مقابل بوابة ارتفاع FSC (FSC-H) لإزالة الثنائيات. (ب) تم استخدام بوابة ثانية لمنطقة التشتت الأمامية (FSC-A) مقابل منطقة التشتت الجانبية (SSC-A) لإزالة الحطام على أساس الحجم والكثافة. (ج، د) حددت بوابة SSC-A مقابل CD45 خلايا من أصل المكونة للدم ، وحددت بوابة SSC-A مقابل بوابة CD14 البلاعم. (ه) تم ربط البلاعم الكلية CD45+/CD14+ استنادا إلى علامة HLA-DR وتم تحديد مجموعتين فرعيتين من البلاعم: HLA-DR- وHLA-DR+. توضح المؤامرات البيانات التمثيلية من الموضوعات الفردية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تلعب ضريبة القيمة المضافة دورا مهما في تنظيم التمثيل الغذائي والالتهابات. أدى الاهتمام المتزايد بدور الخلايا الشحمية والخلايا المناعية في الالتهاب المزمن المرتبط بالسمنة إلى تطوير تقنيات مختلفة لفصل SVF والخلايا الدهنية الموجودة في AT. ومع ذلك ، فإن معظم التقنيات لا تسمح بالحصول على هاتين المجموعتين المختلفتين من الخلايا القابلة للتطبيق للتطبيقات النهائية من نفس خزعة ضريبة القيمة المضافة في إجراء واحد ، والذي قد يكون حاسما للدراسات المتعلقة بالتفاعلات بين الخلايا الشحمية وخلايا SVF. لذلك ، قمنا بتنفيذ هذا البروتوكول الذي يوفر وصفا مفصلا لعزل الخلايا الشحمية الناضجة القابلة للحياة وخلايا SVF الموجودة في خزعة ضريبة القيمة المضافة. وهو يختلف عن التقارير السابقة في وقت هضم الأنسجة وتركيز الكولاجيناز ، وكذلك وقت وسرعة الطرد المركزي لفصل الخلايا ، مما يتيح إنتاجية كافية من الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية وتوصيف مجموعة فرعية مفصلة من البلاعم.

تم اقتراح كمية كبيرة من تقنيات العزل الأنزيمي وغير الأنزيمي للخلايا المشتقة من AT ، مع تأثيرات مختلفة على الخصائص البيولوجية والخصائص الوظيفية للخلايا المعزولة17،21،22،23،24 ، لذلك من الضروري اختيار الاستراتيجية الأنسب وفقا للهدف المنشود. في كثير من الأحيان ، يتم تحقيق الخلايا الشحمية الناضجة وعزل SVF من الأنسجة الدهنية باستخدام إنزيمات تفكك الأنسجة25،26،27. على الرغم من أنه يمكن استخدام إنزيمات مختلفة لفصل AT ، إلا أن الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز يظل المعيار الذهبي لهضم هذا النسيج27,28. نظرا لأن ضريبة القيمة المضافة تتكون من مصفوفة ناعمة ، يمكن هضمها بسهولة باستخدام كولاجيناز من النوع الثاني. يتجنب هذا الإجراء تفكك الأنسجة غير السليم لأن هذا الإنزيم يعطل الكولاجين الأصلي للمصفوفة خارج الخلية ، ويطلق العديد من الخلايا من السدى الليفي ، مع تأثير ضئيل على صلاحية الخلية ، وإنتاجية الخلايا ، وتعبير التمايز العنقودي19،27،28،29.

فيما يتعلق بالهضم الأنزيمي ، من الضروري أيضا مراعاة تركيز الإنزيم وفترة الهضم بالإضافة إلى معلمات الطرد المركزي لتصميم بروتوكول مناسب لعزل الخلايا الشحمية الناضجة وخلايا SVF من ضريبة القيمة المضافة لأن هذه العوامل قد تؤثر على النمط الظاهري للخلية والتعافي والبقاء في تعليق الخلية النهائي27,29. يعد استخدام كولاجيناز كإنزيم محلل للبروتين مثاليا عند التركيز المنخفض [النطاق 0.075٪ a 0.3٪ (w / v)] ، مع فترة حضانة أقل من 2 ساعة ، وبالتالي فإن خصائص SVF المظهرية والوظيفية مثل معدل الانتشار وقدرة التمايز وتكرار سلالات خلوية محددة ، تظل دون تغيير30,31. نحن نستخدم فترة هضم قصوى تبلغ 60 دقيقة و 0.25٪ كولاجيناز ، مما يقلل من تركيز وطول التعرض للكولاجيناز للحصول على تأثير ضئيل على الجدوى الخلوية وتعبير علامات سطح خلايا SVF ، وتجنب النتائج المنحرفة في تحليل قياس التدفق الخلوي. نقوم أيضا بتضمين خطوات الطرد المركزي اللطيفة وأوقات الطرد المركزي الأقصر التي تبلغ 200 جم / 5 دقائق لتحسين استعادة الخلايا أثناء فصل الخلايا الدهنية ، مما يمثل ميزة للبروتوكول ، نظرا لأن فترات الطرد المركزي الطويلة والمكثفة [فوق 400 جم / 1 دقيقة] تزيد من موت الخلايا الشحمية ، مما يحد من العائد الخلوي32،33،34. يشبه الانتعاش الخلوي SVF الذي تم تحقيقه من خلال بروتوكول الهضم القائم على الكولاجين الغلة النموذجية ل 2-6 × 106 خلايا / جم AT المبلغ عنها في الأدبيات ، في حين أن صلاحية SVF البالغة 63.9 ± 2.0 أقل بشكل معتدل من الحد الأدنى المقترح البالغ 70٪ -80٪ لهذا النوع من الخلايا35،36،37،38. هذا على الأرجح لأننا لا نستخدم وسائط الاستزراع لإعادة تعليق خلايا SVF كبروتوكولات قياسية ، لأننا نميز مجموعة البلاعم من خلال علامات سطحها ، وقد تم الإبلاغ عن أن هذه الخلايا تظهر مرونة ملحوظة استجابة للظروف البيئية ، حتى أنها تغير نمطها الظاهري39،40،41.

بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أيضا الإشارة إلى أن النساء الحوامل المشمولات في هذا البروتوكول كمتبرعات بضريبة القيمة المضافة كن بصحة جيدة ، مع عدم وجود دليل سريري على الأمراض المصاحبة الأيضية ، وزيادة الوزن الطبيعية أثناء الحمل ، ومتوسط العمر 20-25 سنة ، ومؤشر كتلة الجسم الطبيعي قبل الحمل (مؤشر كتلة الجسم 18.5-24.9 كجم / م2 ؛ n = 7) ، لأن بعض المؤلفين وصفوا أن المتبرعين المختلفين والعمر ومؤشر كتلة الجسم والجنس أو العرق لها تأثير على رقم الخلية ، والتعبير عن علامات سطح SFV42،43،44.

من ناحية أخرى ، يتطلب تحليل ملف تعريف التعبير الجيني كميات معقولة من الحمض النووي الريبي السليم ، ولكن عزله عن الخلايا الشحمية الناضجة صعب بشكل خاص لأن هذه الخلايا تحتوي على نسبة دهون أعلى وفي بعض الحالات ، يكون عدد الخلايا منخفضا45،46،47،48. لقد قمنا بتحسين إجراء عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الشحمية الناضجة بناء على طريقة جوانيدين أيزوثيوسيانات / الفينول القياسية49,50 ، وتنفيذ خطوات سهلة تمكن من التخلص من الدهون والحطام الخلوي. بعد تحضير العينة ، يسمح لنا استخراج الحمض النووي الريبي القائم على العمود بالحصول على حمض نووي ريبوزي عالي الجودة خال من الحمض النووي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير ، وهو أمر غير معتاد تماما بالنسبة لعينات AT. يضمن التحقق من نقاء وسلامة هذه الحمض النووي الريبي من خلال محلل مراقبة جودة الحمض النووي الريبي القائم على الموائع الدقيقة أن جودة الحمض النووي الريبي المعزول مناسبة للتطبيقات النهائية مثل مقايسات RT-qPCR والمصفوفات الدقيقة للتعبير.

إلى جانب المزايا المذكورة من قبل ، فإن هضم ال باستخدام كولاجيناز يسمح بتحرير الخلايا الشحمية والخلايا المناعية المقيمة في وقت واحد ، والحفاظ على سلامة مستقبلات سطح الخلية. هذه حقيقة مهمة أثناء عزل خلية SVF للحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي الموثوقة والقابلة للتفسير27. بالإضافة إلى ذلك ، تميل الخلايا المعزولة من الأنسجة المحملة بالدهون مثل ضريبة القيمة المضافة إلى أن تكون أكثر عرضة للتجميع ، مما يقلل من إنتاجية الخلايا المصنفة ، ويزيد من التألق الذاتي51. في البروتوكول ، فإن التخلص من مجاميع الخلايا هذه عن طريق الترشيح من خلال ثلاث طبقات من الشاش قبل الفرز واستبعادها باستخدام استراتيجية البوابة الموصوفة ، يقلل من مضان الخلفية ، ويحسن جودة العينة لفرز الخلايا.

أجريت دراسات سابقة لتحديد الخلايا الموجودة في SVF باستخدام مجموعة واحدة من علامات CD المميزة لهذه الخلايا52،53،54،55،56،57،58،59. لمزيد من التوصيف المتعمق للأنواع الفرعية للبلاعم في VAT SVF ، قمنا بتصنيف هذه الخلايا عن طريق التعبير عن علامات سطح خلية محددة. وفقا لتعبير علامات CD45 و CD14 المستخدم لتحديد خلايا خط الخلايا الوحيدة / البلاعم في VAT60 ، وجدنا أن هذا النسيج يتكون من مجموعة بلاعم CD45 + CD14 + نموذجية من أصل المكونة للدم. باستخدام نفس البروتوكول ، تمكنا في دراسة سابقة من توصيف مجموعات الضامة M1 (CD11c) و M2 (CD163 و CD206)20.

تم تصنيف التنميط الظاهري للبلاعم داخل AT على أنه طيف من البلاعم المؤيدة للالتهابات (المنشطة بشكل كلاسيكي - M1) إلى البلاعم المضادة للالتهابات (بدلا من ذلك المنشطة - M2) وفقا لوجود علامات تنشيط مختلفة على سطحه61,62. تعكس علامة البلاعم HLA-DR درجة تنشيط البلاعم63,64 ، وقد تم دمجها في البروتوكول لإنشاء النمط الظاهري M1 أو M2: مجموعات البلاعم التي تعبر عن HLA-DR + التهابية و HLA-DR- تمثل الضامة غير الالتهابية. لذلك ، بناء على تعبير علامة HLA-DR ، تم تعريف مجموعتين فرعيتين من البلاعم: CD45 + CD14 + HLA-DR- و CD45 + CD14 + HLA-DR + ، والتي تنشأ من الخلايا الوحيدة المتداولة والمعروفة باسم الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة داخل الأنسجة الدهنية65,66.

بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بقياس CD11c (علامة M1) ، وكذلك CD163 و CD206 (علامة M2) على كل نوع فرعي من البلاعم ، وتحديد أن البلاعم AT تعرض جميع علامات التنشيط التي تم تقييمها على سطح الغشاء ، مما يدل على أن البلاعم الموجودة في ضريبة القيمة المضافة من النساء الحوامل لها خصائص أكثر تعقيدا من تلك الموصوفة للتصنيفات المبسطة بشكل مفرط لمجموعات الضامة M1 و M2. لذا ، فإن تطبيق قياس التدفق الخلوي الأساسي مع لوحة الأجسام المضادة متعددة الألوان وبوابات الخلايا الصارمة يجعل من الممكن تحديد وتوصيف البلاعم من مجموعة الخلايا غير المتجانسة في SVF. يمكن أن يكون التنميط الظاهري للبلاعم المكررة الذي تم الحصول عليه باستخدام البروتوكول مفيدا في الدراسات التي أجريت لتوضيح التغيرات الديناميكية لمجموعات البلاعم في AT والتي تؤدي إلى اضطراب في توازن AT.

على الرغم من أن هذا البروتوكول تم تصميمه لتوصيف بلاعم ضريبة القيمة المضافة ، إلا أن التعديلات التي تم إجراؤها في لوحة الأجسام المضادة يمكن أن توسع تطبيقاتها لتسهيل فرز الخلايا المناعية الأخرى الموجودة في AT، حيث تتوفر العديد من الأجسام المضادة الفلورية لتحديد علامات محددة من سلالات مختلفة. علاوة على ذلك ، تسمح الطريقة باستخدام مجموعات الخلايا التي يتم تنقيتها عن طريق فرز الخلايا لتحليلات ما بعد الفرز مثل استخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي / البروتين أو العلاجات خارج الجسم الحي ، والحصول على الخلايا مباشرة في وسط مناسب بتقنيات العقم.

باختصار ، نعتبر أن البروتوكول المفصل هنا يمثل المفاضلة الأكثر كفاءة بين الوقت والموارد والعائد الخلوي وصلاحية الخلية ، إلى جانب كونه عالي الكفاءة لاستخراج الحمض النووي الريبي والميرنا من الخلايا الدهنية ، وتوصيف مجموعة البلاعم في AT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من المعهد الوطني للطب البيريناتولوجي (أرقام المنح: 3300-11402-01-575-17 و 212250-3210-21002-06-15) و CONACyT ، الصندوق القطاعي للتحقيق في الصحة والأمن الاجتماعي (FOSISS) (رقم المنحة 2015-3-2-61661).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes Corning CLS4101-50EA Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-L-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip Axygen T-300-R-S RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip Axygen T-1000-B-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube Axygen MCT-200-C RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip Axygen T-200-Y-R RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA -
2101 Bioanalyzer PC Agilent G2953CA 2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube Corning 352003  Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes Corning CLS430828-100EA Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent Zymo Research R2050-1-200 TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067-1511 -
Agilent Small RNA Kit Agilent 5067-1548 -
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody BioLegend 325620 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker - - 250 ml, non sterile
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912-100G Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station Agilent 5065-9951 -
Collagenase type II Gibco 17101-015 Powder
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G Powder
Direct-zol RNA Miniprep Zymo Research R2051 Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps - - Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray - - Stainless steel
Ethyl alcohol Sigma-Aldrich E7023-500ML 200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid BD Biosciences 342003 -
FACS Lysing Solution BD Biosciences 349202 -
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter BD Biosciences 648282 -
FASCDiva Software BD Biosciences 642868 Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer Sigma Z359629-1EA -
Manual cell counter - - -
Mayo dissecting scisors - - Stainless steel
Microcentrifuge - - Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND2000LAPTOP -
Orbital shaker - - Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642040 1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642090 100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642010 0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette  Thermo Scientific-Finnpipette 4642080 20 to 200 μL
PCR tube storage rack Axygen R96PCRFSP -
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody BioLegend 307608 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody BioLegend 304016 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P3813-10PAK Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller - - -
Red Blood Cells Lysis Buffer Roche 11 814 389 001 For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge - - Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container - - -
Transfer pipette Thermo Scientific-Samco 204-1S Sterile
Trypan Blue Gibco 15250-061 0.4% Solution
Tube racks - - For different tube sizes
Vortex Mini Shaker Cientifica SENNA BV101 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403 (2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613 (2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202 (2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015 (2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88 (2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074 (2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457 (2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282 (2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321 (2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54 (2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610 (2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59 (2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693 (2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212 (2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472 (2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115 (2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807 (2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683 (2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514 (2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Tags

عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة ، الجزء الوعائي اللحمي ، تحليل الحمض النووي الريبي ، التنميط الظاهري للبلاعم ، الأنسجة الدهنية الحشوية ، العضو الأيضي ، الخلايا الشحمية الناضجة ، الجزيئات النشطة بيولوجيا ، العمليات المناعية ، الفيزيولوجيا المرضية للأنسجة الدهنية ، خطوات العزل ، إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، تقنية الهضم الأنزيمي كولاجيناز ، مجموعات فرعية من البلاعم ، دراسات التعبير الجيني ، تعليق الخلية الواحدة ، عزل الحمض النووي الريبي للخلايا الشحمية الناضجة
عزل الخلايا الشحمية القابلة للحياة وجزء الأوعية الدموية اللحمية من الأنسجة الدهنية الحشوية البشرية المناسبة لتحليل الحمض النووي الريبي والتنميط الظاهري للبلاعم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, … More

Estrada-Gutierrez, G., Bravo-Flores, E., Ortega-Castillo, V., Flores-Rueda, V., Mancilla-Herrera, I., Espino Y Sosa, S., Sánchez-Martínez, M., Perichart-Perera, O., Solis-Paredes, M. Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping. J. Vis. Exp. (164), e61884, doi:10.3791/61884 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter