Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.
Viseral yağ dokusu (VAT), metabolik, hormonal ve immün süreçleri kontrol eden farklı biyoaktif molekülleri serbest bırakan, esas olarak olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinden oluşan aktif bir metabolik organdır; Şu anda, bu süreçlerin yağ dokusu içinde nasıl düzenlendiği belirsizdir. Bu nedenle, her hücre popülasyonunun yağ dokusunun patofizyolojisine katkısını değerlendiren yöntemlerin geliştirilmesi çok önemlidir. Bu protokol, izolasyon adımlarını açıklar ve bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanılarak insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF’nin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için gerekli sorun giderme yönergelerini sağlar. Ayrıca, protokol ayrıca makrofaj alt kümelerini tanımlamak ve gen ekspresyonu çalışmaları için olgun adiposit RNA izolasyonu gerçekleştirmek için optimize edilmiştir, bu da bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi inceleyen çalışmaların yapılmasına izin verir. Kısaca, KDV biyopsileri yıkanır, mekanik olarak kıyılır ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için sindirilir. Santrifüjlemeden sonra, olgun adipositler, SVF peletinden yüzdürme yoluyla izole edilir. RNA ekstraksiyon protokolü, aşağı akış ekspresyon deneyleri için adipositlerden yüksek miktarda toplam RNA (miRNA’lar dahil) verimi sağlar. Aynı zamanda, SVF hücreleri, akış sitometrisi analizi yoluyla makrofaj alt kümelerini (pro- ve anti-inflamatuar fenotip) karakterize etmek için kullanılır.
Beyaz yağ dokusu sadece yağ hücrelerinden veya adipositlerden değil, aynı zamanda makrofajlardan, düzenleyici T hücreleri (Treg’ler) olarak diğer bağışıklık hücrelerinden ve eozinofillerden, preadipositlerden ve fibroblastlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu içeren stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak bilinen yağsız bir hücre fraksiyonundan oluşurve vasküler ve bağ dokusu ile çevrilidir 1,2. Yağ dokusu (AT) artık otokrin, parakrin ve endokrin etkileri ile farklı hücreler tarafından üretilen ve dokuya salınan adipokinler, sitokinler ve mikroRNA’lar aracılığıyla metabolizma ve iltihaplanma ile ilgili fizyolojik süreçleri düzenleyen bir organ olarak kabul edilmektedir 3,4. İnsanlarda beyaz yağ dokusu, deri altı yağ dokusu (SAT) ve viseral yağ dokusunu (VAT) içerir ve aralarında önemli anatomik, moleküler, hücresel ve fizyolojik farklılıklar vardır 2,5. SAT, insan AT’sinin %80’ini temsil ederken, VAT karın boşluğunda, özellikle mezenter ve omentumda bulunur ve metabolik olarak daha aktiftir6. Ayrıca VAT, vücut ağırlığı, insülin duyarlılığı, lipid metabolizması ve inflamasyon üzerinde önemli etkisi olan aracıları salgılayan bir endokrin organdır. Sonuç olarak, KDV birikimi abdominal obeziteye ve tip-2 diyabet, metabolik sendrom, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık riski gibi obezite ile ilişkili hastalıklara yol açar ve obezite ile ilişkili mortalitenin daha iyi bir yordayıcısını temsil eder 6,7,8,9.
Homeostatik koşullarda, adipositler, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, anti-enflamatuar mediatörlerin salgılanması yoluyla KDV metabolizmasını sürdürmek için işbirliği yapar10. Bununla birlikte, aşırı KDV genişlemesi, aktive edilmiş T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve makrofajların alımını teşvik eder. Nitekim yağsız KDV’de makrofajların oranı %5 iken, obezitede bu oran %50’ye kadar yükselmekte, makrofaj polarizasyonu ile anti-inflamatuardan pro-inflamatuar fenotipe doğru kronik inflamatuar bir ortam oluşturmaktadır10,11.
Obezite pandemisinin bir sonucu olarak, diğerlerinin yanı sıra adiposit biyolojisi, epigenetik, inflamasyon, endokrin özellikler ve hücre dışı veziküller olarak ortaya çıkan alanlar dahil olmak üzere farklı KDV araştırma konularını ele alan şaşırtıcı sayıda rapor ortaya çıkmıştır 8,10,12,13. Bununla birlikte, KDV ortamı, adipositler ile yerleşik veya gelen makrofajlar arasındaki karışma ile tanımlansa da, çoğu çalışma yalnızca bir hücre popülasyonuna odaklanmıştır ve bu hücrelerin KDV’deki etkileşimi ve patofizyolojik sonuçları hakkında çok az bilgi vardır11,14. Ayrıca, AT’de adiposit-makrofaj etkileşimini ele alan değerli çalışmalar, in vivo hazırlama koşullarından yoksun hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir 11,14,15. Bu hücrelerin KDV’deki etkileşimini veya özel katkısını incelemek için uygun bir strateji, KDV metabolizmasını düzenleyen in vivo özellikleri mümkün olduğunca benzer şekilde yansıtan in vitro tahliller gerçekleştirmek için her iki hücre tipinin de aynı yağ biyopsisinden izole edilmesini gerektirir.
AT’yi kırmak için mekanik kuvvetlere dayanan enzimatik olmayan ayrışma yöntemleri minimum manipülasyon sağlasa da, enzimatik yöntemlere kıyasla hücre geri kazanımında daha düşük etkinliğe ve düşük hücre canlılığına sahip olduklarından ve daha büyük bir doku hacmine ihtiyaç duyulduğundan, amaç SVF hücrelerini incelemek ise bu yöntemler kullanılamaz16,17. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, WAT18 gibi fibröz dokuların kollajen ve hücre dışı matriks proteinlerinin yeterli sindirimine izin veren nazik bir yöntemdir ve tripsin etkisiz veya zararlı olduğundasıklıkla kullanılır 19. Protokol, bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanarak, insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar ve aşağı akış ekspresyon uygulamaları için mikroRNA’lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden toplam RNA’nın yüksek verimini (miktar, saflık ve bütünlük) sağlamak için bilgi verir. Eşzamanlı olarak, protokol, akış sitometrisi20 ile daha fazla analiz için çoklu zara bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF hücrelerinden makrofaj alt kümelerini tanımlamak için optimize edilmiştir.
KDV, metabolik düzenleme ve inflamasyonda çok önemli bir rol oynar. Obezite ile ilişkili kronik inflamasyonda adipositlerin ve immün hücrelerin rolüne olan ilginin artması, AT’de bulunan SVF ve yağ hücrelerini ayırmak için farklı tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu teknik, adipositler ve SVF hücreleri arasındaki etkileşimlerle ilgili çalışmalar için çok önemli olabilecek tek bir prosedürde aynı KDV biyopsisinden aşağı akış uygulamaları için uygun olan bu…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Instituto Nacional de Perinatologia (hibe numaraları: 3300-11402-01-575-17 ve 212250-3210-21002-06-15) ve CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (hibe numarası 2015-3-2-61661) tarafından desteklenmiştir.
0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | – |
2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | – |
Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | – |
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
Baker | – | – | 250 ml, non sterile |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | – |
Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
Dissecting forceps | – | – | Steel, serrated jaws and round ends |
Dissection tray | – | – | Stainless steel |
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | – |
FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | – |
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | – |
FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | – |
Manual cell counter | – | – | – |
Mayo dissecting scisors | – | – | Stainless steel |
Microcentrifuge | – | – | Adjustable temperature |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | – |
Orbital shaker | – | – | Adjustable temperature and speed |
P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | – |
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
Pipette controller | – | – | – |
Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
Refrigerated centrifuge | – | – | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
Sterile Specimen container | – | – | – |
Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
Tube racks | – | – | For different tube sizes |
Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | – |