Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Summary

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Abstract

O tecido adiposo visceral (TAV) é um órgão metabólico ativo composto principalmente por adipócitos maduros e células da fração vascular estromal (FRS), que liberam diferentes moléculas bioativas que controlam processos metabólicos, hormonais e imunológicos; Atualmente, não está claro como esses processos são regulados dentro do tecido adiposo. Portanto, o desenvolvimento de métodos que avaliem a contribuição de cada população celular para a fisiopatologia do tecido adiposo é crucial. Este protocolo descreve as etapas de isolamento e fornece as diretrizes de solução de problemas necessárias para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e SVF de biópsias de TAV humano em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase. Além disso, o protocolo também é otimizado para identificar subgrupos de macrófagos e realizar isolamento de RNA de adipócitos maduros para estudos de expressão gênica, o que permite a realização de estudos dissecando a interação entre essas populações celulares. Resumidamente, as biópsias de IVA são lavadas, picadas mecanicamente e digeridas para gerar uma suspensão de célula única. Após a centrifugação, adipócitos maduros são isolados por flutuação do pellet de SVF. O protocolo de extração de RNA garante um alto rendimento de RNA total (incluindo miRNAs) de adipócitos para ensaios de expressão a jusante. Simultaneamente, as células SVF são usadas para caracterizar subtipos de macrófagos (fenótipo pró e anti-inflamatório) por meio da análise por citometria de fluxo.

Introduction

O tecido adiposo branco é composto não apenas por células adiposas ou adipócitos, mas também por uma fração de células não adiposas conhecida como fração vascular estromal (FVS), que contém uma população celular heterogênea constituída por macrófagos, outras células imunes como células T reguladoras (Tregs), eosinófilos, pré-adipócitos e fibroblastos, circundados por tecido vascular e conjuntivo ^1,2. O tecido adiposo (TA) é hoje considerado um órgão que regula processos fisiológicos relacionados ao metabolismo e à inflamação por meio de adipocinas, citocinas e microRNAs produzidos e liberados por diferentes células no tecido, com efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos ^3,4. Em humanos, o tecido adiposo branco compreende o tecido adiposo subcutâneo (TAS) e o tecido adiposo visceral (TAV), com importantes diferenças anatômicas, moleculares, celulares e fisiológicas entre eles ^2,5. O TSA representa até 80% do TA humano, enquanto o TAA localiza-se dentro da cavidade abdominal, principalmente no mesentério e omento, sendo metabolicamente mais^ativo6. Além disso, o TAV é um órgão endócrino que secreta mediadores com impacto substancial no peso corporal, sensibilidade à insulina, metabolismo lipídico e inflamação. Consequentemente, o acúmulo de TAV leva à obesidade abdominal e a doenças relacionadas à obesidade, como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, hipertensão e risco de doença cardiovascular, representando um melhor preditor de mortalidade associada à obesidade 6,7,8,9.

Em condições homeostáticas, adipócitos, macrófagos e outras células imunes cooperam para manter o metabolismo do LV através da secreção de mediadores anti-inflamatórios¹⁰. No entanto, a expansão excessiva do TAV promove o recrutamento de células T ativadas, células NK e macrófagos. De fato, no LV magro, a proporção de macrófagos é de 5%, enquanto na obesidade essa relação sobe até 50%, com polarização dos macrófagos do fenótipo anti-inflamatório para o pró-inflamatório, gerando um ambiente inflamatório crônico^10,11.

Como consequência da pandemia de obesidade, um número surpreendente de relatos tem surgido abordando diferentes tópicos de pesquisa em TAV, incluindo biologia de adipócitos, epigenética, inflamação, propriedades endócrinas, áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre outros 8,10,12,13. No entanto, embora o ambiente de LV seja definido pelo crosstalk entre adipócitos e macrófagos residentes ou chegantes, a maioria dos estudos tem focado em apenas uma população celular, e há poucas informações sobre a interação dessas células no TAV e suas consequências fisiopatológicas11,14. Além disso, estudos valiosos abordando a interação adipócito-macrófago no TA foram realizados utilizando linhagens celulares, sem as condições de priming in vivo 11,14,15. Uma estratégia adequada para dissecar a interação ou a contribuição particular dessas células no TAV requer o isolamento de ambos os tipos celulares da mesma biópsia de gordura para realizar ensaios in vitro que espelhem o mais semelhante possível as propriedades in vivo que regulam o metabolismo do TAV.

Embora os métodos de dissociação não enzimática baseados em forças mecânicas para quebrar o TA garantam mínima manipulação, esses métodos não podem ser utilizados se o objetivo for estudar as células da FVS, pois apresentam menor eficiência na recuperação celular e baixa viabilidade celular em comparação aos métodos enzimáticos, sendo necessário maior volume de tecido^16,17. A digestão enzimática com colagenase é um método suave que permite a digestão adequada do colágeno e das proteínas da matriz extracelular de tecidos fibrosos, como o WAT¹⁸, e é frequentemente utilizada quando a tripsina é ineficaz ou lesiva¹⁹. O protocolo fornece diretrizes fundamentais de solução de problemas para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias humanas de IVA em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase, fornecendo informações para garantir altos rendimentos (quantidade, pureza e integridade) de RNA total de adipócitos maduros, incluindo microRNAs, para aplicações de expressão a jusante. Simultaneamente, o protocolo é otimizado para identificar subtipos de macrófagos de células SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para posterior análise por citometria de fluxo²⁰.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo CEP do Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). A participação foi voluntária e todas as mulheres inscritas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. 1. Coleção de tecido adiposo visceral Obter biópsias de IVA através de omentectomia parcial durante cesariana de mulheres adultas saudáveis com gravidez única a termo sem trabalho de parto. Após o fechamento uterino e hemostasia, proceder à identif…

Representative Results

Este protocolo descreve um método enzimático utilizando digestão de colagenase seguida de centrifugação diferencial para isolar, em um único processo, adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias de TAV obtidas de gestantes saudáveis após omentectomia parcial. Neste caso, utilizamos os adipócitos para extração de RNA e a FVA para fenotipagem de macrófagos. O protocolo de extração de RNA permitiu a obtenção de RNA com pureza adequada, alta integridade e microRNAs de …

Discussion

O IVA desempenha um papel crucial na regulação metabólica e inflamação. O crescente interesse no papel dos adipócitos e das células imunes na inflamação crônica associada à obesidade levou ao desenvolvimento de diferentes técnicas para separar a FVS das células adiposas presentes na TA. No entanto, a maioria das técnicas não permite obter esses dois diferentes conjuntos de células viáveis para aplicações a jusante a partir de uma mesma biópsia de TAV em um único procedimento, o que poderia ser crucia…

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–