Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Summary

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Abstract

Visceraal vetweefsel (VAT) is een actief metabolisch orgaan dat voornamelijk bestaat uit rijpe adipocyten en stromale vasculaire fractie (SVF)-cellen, die verschillende bioactieve moleculen afgeven die metabole, hormonale en immuunprocessen regelen; Momenteel is het onduidelijk hoe deze processen in het vetweefsel worden gereguleerd. Daarom is de ontwikkeling van methoden die de bijdrage van elke celpopulatie aan de pathofysiologie van vetweefsel evalueren, cruciaal. Dit protocol beschrijft de isolatiestappen en biedt de nodige richtlijnen voor het oplossen van problemen voor een efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF uit menselijke VAT-biopsieën in één enkel proces, met behulp van een collagenase enzymatische verteringstechniek. Bovendien is het protocol ook geoptimaliseerd om macrofaagsubsets te identificeren en volwassen adipocyten-RNA-isolatie uit te voeren voor genexpressiestudies, waardoor studies kunnen worden uitgevoerd om de interactie tussen deze celpopulaties te ontleden. In het kort worden btw-biopsieën gewassen, mechanisch gehakt en verteerd om een eencellige suspensie te genereren. Na centrifugatie worden rijpe adipocyten geïsoleerd door flotatie uit de SVF-pellet. Het RNA-extractieprotocol zorgt voor een hoge opbrengst van totaal RNA (inclusief miRNA’s) uit adipocyten voor stroomafwaartse expressietests. Tegelijkertijd worden SVF-cellen gebruikt om macrofaagsubsets (pro- en anti-inflammatoir fenotype) te karakteriseren door middel van flowcytometrie-analyse.

Introduction

Wit vetweefsel bestaat niet alleen uit vetcellen of adipocyten, maar ook uit een niet-vette celfractie die bekend staat als stromale vasculaire fractie (SVF), die een heterogene celpopulatie bevat die bestaat uit macrofagen, andere immuuncellen als regulerende T-cellen (Tregs) en eosinofielen, preadipocyten en fibroblasten, omgeven door vasculair en bindweefsel ^1,2. Vetweefsel (AT) wordt nu beschouwd als een orgaan dat fysiologische processen reguleert die verband houden met metabolisme en ontsteking door middel van adipokines, cytokines en microRNA’s die door verschillende cellen worden geproduceerd en in het weefsel worden afgegeven, met autocriene, paracriene en endocriene effecten ^3,4. Bij mensen omvat wit vetweefsel het onderhuidse vetweefsel (SAT) en het viscerale vetweefsel (VAT), met belangrijke anatomische, moleculaire, cellulaire en fysiologische verschillen tussen hen ^2,5. SAT vertegenwoordigt tot 80% van de menselijke AT, terwijl VAT zich in de buikholte bevindt, voornamelijk in het mesenterium en het omentum, en metabolisch actiever is⁶. Bovendien is VAT een endocrien orgaan dat mediatoren afscheidt met een substantiële invloed op het lichaamsgewicht, de insulinegevoeligheid, het lipidenmetabolisme en ontstekingen. Bijgevolg leidt btw-accumulatie tot abdominale obesitas en aan obesitas gerelateerde ziekten zoals diabetes type 2, metabool syndroom, hypertensie en het risico op hart- en vaatziekten, wat een betere voorspeller is van obesitas-gerelateerde mortaliteit 6,7,8,9.

In homeostatische omstandigheden werken adipocyten, macrofagen en de andere immuuncellen samen om het VAT-metabolisme in stand te houden door de afscheiding van ontstekingsremmende mediatoren¹⁰. Buitensporige btw-verhoging bevordert echter de rekrutering van geactiveerde T-cellen, NK-cellen en macrofagen. In feite is de verhouding van de macrofagen bij magere btw 5%, terwijl deze verhouding oploopt tot 50% bij obesitas, waarbij macrofaagpolarisatie van ontstekingsremmend naar pro-inflammatoir fenotype ontstaat, waardoor een chronische ontstekingsomgeving ontstaat^10,11.

Als gevolg van de obesitaspandemie is er een verbazingwekkend aantal rapporten verschenen over verschillende btw-onderzoeksonderwerpen, waaronder adipocytenbiologie, epigenetica, ontsteking, endocriene eigenschappen en opkomende gebieden zoals extracellulaire blaasjes, onder andere 8,10,12,13. Hoewel de btw-omgeving wordt bepaald door overspraak tussen adipocyten en de residente of aankomende macrofagen, hebben de meeste onderzoeken zich gericht op slechts één celpopulatie en is er weinig informatie over de interactie van deze cellen in btw en hun pathofysiologische gevolgen^11,14. Bovendien werden waardevolle studies naar het adipocyt-macrofaag-samenspel in AT uitgevoerd met behulp van cellijnen, zonder de in vivo priming-omstandigheden 11,14,15. Een geschikte strategie om de interactie of de specifieke bijdrage van deze cellen in VAT te ontleden, vereist de isolatie van beide celtypen uit dezelfde vetbiopsie om in vitro assays uit te voeren die de in vivo eigenschappen die het VAT-metabolisme reguleren zo veel mogelijk weerspiegelen.

Hoewel de niet-enzymatische dissociatiemethoden op basis van mechanische krachten om de AT te breken minimale manipulatie garanderen, kunnen deze methoden niet worden gebruikt als het doel is om SVF-cellen te bestuderen, omdat ze een lagere efficiëntie hebben bij celherstel en een lage cellevensvatbaarheid in vergelijking met enzymatische methoden, en er een groter weefselvolume nodig is^16,17. Enzymatische vertering met behulp van collagenase is een zachte methode die een adequate vertering van collageen en extracellulaire matrixeiwitten van vezelachtige weefsels zoals WAT¹⁸ mogelijk maakt en wordt vaak gebruikt wanneer trypsine niet effectief of schadelijk is¹⁹. Het protocol biedt fundamentele richtlijnen voor het oplossen van problemen voor efficiënte isolatie van levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen uit menselijke VAT-biopsieën in een enkel proces, met behulp van een collagenase-enzymatische verteringstechniek, en geeft informatie om hoge opbrengsten (hoeveelheid, zuiverheid en integriteit) van totaal RNA uit rijpe adipocyten, inclusief microRNA’s, te garanderen voor stroomafwaartse expressietoepassingen. Tegelijkertijd is het protocol geoptimaliseerd om macrofaagsubsets van SVF-cellen te identificeren door middel van de kleuring van meerdere membraangebonden markers voor verdere analyse door middel van flowcytometrie²⁰.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de IRB van het Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). Deelname was vrijwillig en alle ingeschreven vrouwen ondertekenden het formulier voor geïnformeerde toestemming. 1. Verzameling van visceraal vetweefsel Verkrijg btw-biopsieën door middel van gedeeltelijke omentectomie tijdens een keizersnede van gezonde volwassen vrouwen met eenlingzwangerschappen op termijn zonder arbeid. Ga na de sluiting van de baarmoeder en …

Representative Results

Dit protocol beschrijft een enzymatische methode waarbij gebruik wordt gemaakt van collagenase-digestie gevolgd door differentiële centrifugatie om in één enkel proces levensvatbare rijpe adipocyten en SVF-cellen te isoleren uit VAT-biopsieën verkregen van gezonde zwangere vrouwen na gedeeltelijke omentectomie. In dit geval gebruiken we de adipocyten voor RNA-extractie en de SVF voor macrofaagfenotypering. Het RNA-extractieprotocol maakte het mogelijk om RNA te verkrijgen met een voldoende…

Discussion

BTW speelt een cruciale rol bij metabole regulatie en ontstekingen. Toenemende belangstelling voor de rol van adipocyten en immuuncellen bij de chronische ontsteking die gepaard gaat met obesitas heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende technieken om de SVF en vetcellen die aanwezig zijn in AT te scheiden. De meeste technieken maken het echter niet mogelijk om deze twee verschillende sets cellen die levensvatbaar zijn voor stroomafwaartse toepassingen uit dezelfde btw-biopsie in één enkele procedure te verkri…

Materials

0.2 mL PCR tubes	Axygen	PCR-02-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettes	Corning	CLS4101-50EA	Individually plastic wrapped
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-L-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tip	Axygen	T-300-R-S	RNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tip	Axygen	T-1000-B-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C	RNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tip	Axygen	T-200-Y-R	RNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2939BA	–
2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube	Corning	352003	Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubes	Corning	CLS430828-100EA	Polipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagent	Zymo Research	R2050-1-200	TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	–
Agilent Small RNA Kit	Agilent	5067-1548	–
APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody	BioLegend	325620	0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker	–	–	250 ml, non sterile
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming station	Agilent	5065-9951	–
Collagenase type II	Gibco	17101-015	Powder
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Powder
Direct-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps	–	–	Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray	–	–	Stainless steel
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	–
FACS Lysing Solution	BD Biosciences	349202	–
FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter	BD Biosciences	648282	–
FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 pre-installed
Hemacytometer	Sigma	Z359629-1EA	–
Manual cell counter	–	–	–
Mayo dissecting scisors	–	–	Stainless steel
Microcentrifuge	–	–	Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000LAPTOP	–
Orbital shaker	–	–	Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 to 200 μL
PCR tube storage rack	Axygen	R96PCRFSP	–
PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody	BioLegend	307608	0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody	BioLegend	304016	0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-10PAK	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller	–	–	–
Red Blood Cells Lysis Buffer	Roche	11 814 389 001	For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge	–	–	Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container	–	–	–
Transfer pipette	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Sterile
Trypan Blue	Gibco	15250-061	0.4% Solution
Tube racks	–	–	For different tube sizes
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	–