Summary
Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.
Abstract
El tejido adiposo visceral (VAT) es un órgano metabólico activo compuesto principalmente por adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal (SVF), que liberan diferentes moléculas bioactivas que controlan los procesos metabólicos, hormonales e inmunológicos; Actualmente, no está claro cómo se regulan estos procesos dentro del tejido adiposo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos que evalúen la contribución de cada población celular a la fisiopatología del tejido adiposo es crucial. Este protocolo describe los pasos de aislamiento y proporciona las pautas de resolución de problemas necesarias para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa. Además, el protocolo también está optimizado para identificar subconjuntos de macrófagos y realizar el aislamiento de ARN de adipocitos maduros para estudios de expresión génica, lo que permite realizar estudios de disección de la interacción entre estas poblaciones celulares. Brevemente, las biopsias de VAT se lavan, se pican mecánicamente y se digieren para generar una suspensión unicelular. Después de la centrifugación, los adipocitos maduros se aíslan por flotación del gránulo de SVF. El protocolo de extracción de ARN garantiza un alto rendimiento de ARN total (incluidos los miARN) de los adipocitos para los ensayos de expresión posteriores. Al mismo tiempo, las células SVF se utilizan para caracterizar subconjuntos de macrófagos (fenotipo proinflamatorio y antiinflamatorio) mediante análisis de citometría de flujo.
Introduction
El tejido adiposo blanco está compuesto no solo por células grasas o adipocitos, sino también por una fracción de células no grasas conocida como fracción vascular estromal (SVF), que contiene una población celular heterogénea formada por macrófagos, otras células inmunitarias como células T reguladoras (Tregs) y eosinófilos, preadipocitos y fibroblastos, rodeados de tejido vascular y conectivo 1,2. El tejido adiposo (TA) es considerado actualmente un órgano que regula los procesos fisiológicos relacionados con el metabolismo y la inflamación a través de adipoquinas, citocinas y microRNAs producidos y liberados por diferentes células en el tejido, con efectos autocrinos, paracrinos y endocrinos 3,4. En el ser humano, el tejido adiposo blanco comprende el tejido adiposo subcutáneo (SAT) y el tejido adiposo visceral (VAT), con importantes diferencias anatómicas, moleculares, celulares y fisiológicas entre ellos 2,5. El SAT representa hasta el 80% de la TA humana, mientras que el VAT se localiza dentro de la cavidad abdominal, principalmente en el mesenterio y el epiplón, siendo metabólicamente más activo6. Además, el VAT es un órgano endocrino que secreta mediadores con un impacto sustancial en el peso corporal, la sensibilidad a la insulina, el metabolismo de los lípidos y la inflamación. En consecuencia, la acumulación de IVA conduce a la obesidad abdominal y a enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo 2, el síndrome metabólico, la hipertensión y el riesgo de enfermedades cardiovasculares, lo que representa un mejor predictor de mortalidad asociada a la obesidad 6,7,8,9.
En condiciones homeostáticas, los adipocitos, macrófagos y otras células inmunitarias cooperan para mantener el metabolismo del VAT a través de la secreción de mediadores antiinflamatorios10. Sin embargo, la expansión excesiva del VAT promueve el reclutamiento de células T activadas, células NK y macrófagos. De hecho, en el VAT magro, la proporción de macrófagos es del 5%, mientras que esta proporción se eleva hasta el 50% en la obesidad, con polarización de macrófagos de fenotipo antiinflamatorio a proinflamatorio, generando un ambiente inflamatorio crónico10,11.
Como consecuencia de la pandemia de obesidad, han surgido una cantidad asombrosa de reportes que abordan diferentes temas de investigación del IVA, incluyendo la biología de los adipocitos, la epigenética, la inflamación, las propiedades endocrinas y las áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre otros 8,10,12,13. Sin embargo, a pesar de que el ambiente VAT está definido por la diafonía entre los adipocitos y los macrófagos residentes o entrantes, la mayoría de los estudios se han centrado en una sola población celular, y existe escasa información sobre la interacción de estas células en el VAT y sus consecuencias fisiopatológicas11,14. Además, se realizaron valiosos estudios que abordaron la interacción adipocito-macrófago en la TA utilizando líneas celulares que carecían de las condiciones de cebado in vivo 11,14,15. Una estrategia adecuada para diseccionar la interacción o la contribución particular de estas células en el VAT requiere el aislamiento de ambos tipos celulares a partir de la misma biopsia de grasa para realizar ensayos in vitro que reflejen lo más similares posible las propiedades in vivo que regulan el metabolismo del VAT.
A pesar de que los métodos de disociación no enzimática basados en fuerzas mecánicas para romper la TA aseguran una mínima manipulación, estos métodos no pueden ser utilizados si el objetivo es estudiar las células SVF, ya que tienen menor eficiencia en la recuperación celular y baja viabilidad celular en comparación con los métodos enzimáticos, y se necesita un mayor volumen de tejido16,17. La digestión enzimática mediante colagenasa es un método suave que permite una digestión adecuada del colágeno y de las proteínas de la matriz extracelular de los tejidos fibrosos como WAT18 y se utiliza con frecuencia cuando la tripsina es ineficaz o dañina19. El protocolo proporciona pautas fundamentales de resolución de problemas para el aislamiento eficiente de adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de VAT humanas en un solo proceso, utilizando una técnica de digestión enzimática de colagenasa, que brinda información para garantizar altos rendimientos (cantidad, pureza e integridad) de ARN total de adipocitos maduros, incluidos microARN, para aplicaciones de expresión posteriores. Al mismo tiempo, el protocolo se optimiza para identificar subconjuntos de macrófagos de células SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su posterior análisis mediante citometría de flujo20.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado por el IRB del Instituto Nacional de Perinatología (212250-3210-21002-06-15). La participación fue voluntaria y todas las mujeres inscritas firmaron el consentimiento informado.
1. Recolección de tejido adiposo visceral
- Obtener biopsias de IVA a través de omentectomía parcial durante la cesárea de mujeres adultas sanas con embarazos únicos a término sin trabajo de parto.
- Tras el cierre uterino y la hemostasia, se procede a identificar el epiplón mayor y extenderlo sobre una compresa húmeda. El AT expuesto es el IVA.
- Localiza el vaso sanguíneo más grande y traza una línea imaginaria de 7 x 5 cm hasta la base del epiplón mayor.
- Identifique una zona avascular y use pinzas de Kelly para perforar el lado externo del VAT.
- Use pinzas de Ochsner para sujetar el lado proximal y distal en la zona donde se perforó VAT y use tijeras Metzenbaum para cortar el tejido.
- Ata el epiplón mayor con el número 1 de seda negra.
- Retire las pinzas de Ochsner y evalúe la hemostasia.
- Coloque la biopsia de IVA en un recipiente estéril y transpórtela al laboratorio de inmediato.
2. Digestión enzimática del tejido adiposo visceral y aislamiento de adipocitos maduros y células de la fracción vascular estromal
- Pesar la biopsia de IVA y enjuagar con 1x PBS pH 7.4.
- Corta 4 g de IVA y utiliza unas tijeras para picar el tejido en trozos pequeños en una bandeja de disección.
- Transfiera el IVA picado a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, agregue 20 ml de PBS y agite suavemente para eliminar el exceso de glóbulos rojos.
- Deseche el PBS y repita el procedimiento dos veces.
- Transfiera el IVA a un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml y agregue 25 ml de solución de digestión (colagenasa tipo II al 0,25 %, glucosa al 5 mM, albúmina al 1,5 % en PBS).
- Incubar a 37 °C durante 60 min en un agitador orbital a 125 rpm.
- Filtre el tejido digerido a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
- Se obtienen dos fases, una fase superior que corresponde a los adipocitos maduros, mientras que las células SFV permanecen en el pellet. Transfiera suavemente los adipocitos maduros a un nuevo tubo de centrífuga estéril de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia.
- Añadir 20 ml de PBS frío, agitar suavemente y centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el PBS y repita el procedimiento dos veces.
- Utilice una pipeta de transferencia para transferir suavemente los adipocitos maduros a un tubo de microcentrífuga libre de DNasa-RNasa de 1,5 ml.
- Centrifugar a 200 x g durante 1 min a 4 °C y eliminar el exceso de PBS con una micropipeta P200. Repita este paso si es necesario.
- Transfiera suavemente 300 μL de suspensión de adipocitos maduros a tubos de microcentrífuga libres de DNasa-RNasa de 1,5 mL. Almacenar los adipocitos maduros a -80 °C hasta la extracción del ARN.
NOTA: Los adipocitos no forman un gránulo. - Una vez separados los adipocitos (paso 2.9), aspirar la mayor parte de la solución de digestión con una pipeta de transferencia, manteniendo el gránulo de SVF en el fondo del tubo.
- Transfiera el gránulo con células SVF a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta de transferencia.
- Lave el gránulo celular suavemente, resuspendiendo en 20 ml de 1x PBS frío pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C y desechar rápidamente el sobrenadante por decantación.
- Realice un segundo lavado repitiendo los pasos 2.17 y 2.18.
- Agregue 5 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos equilibrado a temperatura ambiente (RT) al gránulo SVF y suspenda mediante pipeteo repetido. No haga vórtices.
- Incubar durante 5 min a RT y centrifugar durante 5 min a 800 x g. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia y deséchelo correctamente.
- Para neutralizar el tampón de lisis, agregue 10 ml de PBS frío 1x y mezcle suavemente hasta que el gránulo celular se disuelva.
- Centrifugar a 800 x g durante 5 min para obtener un gránulo SVF y desechar el PBS. Un gránulo blanco debe ser visible en la parte inferior del tubo.
- Resuspender las células en 5 mL de 1x PBS en RT mediante pipeteo repetido y filtradas a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Posteriormente, estas células se utilizarán para la caracterización de subpoblaciones de macrófagos mediante citometría de flujo.
3. Extracción de ARN de adipocitos maduros
- Prepare un área limpia, utilizando un aerosol de descontaminación de ARNasa para evitar la degradación del ARN. Utilice un juego de pipetas reservado para procedimientos de ARN. Todos los tubos y puntas empleados deben estar libres de RNasa.
- Descongelar la suspensión de adipocitos maduros (sección 2.14) a 4 °C si se ha almacenado a -80 °C.
NOTA: Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación. - Lisar las células añadiendo 1.000 μL de reactivo a base de ácido-guanidinio-fenol y mezclar bien con una micropipeta P1000 para homogeneizar.
- Incubar durante 5 minutos en RT para estimular la disociación de los complejos de nucleoproteínas.
- Centrifugar el lisado celular durante 5 min a 12.000 x g a RT. Se obtendrán tres fases: una fase superior (amarilla) correspondiente a los lípidos de los adipocitos, una fase media (rosa) correspondiente a los ácidos nucleicos y un pellet (restos celulares).
- Retire con cuidado la capa lipídica con una micropipeta P200.
- Transfiera la fase media a un nuevo tubo de 2 ml, evitando que los restos de lípidos y los gránulos perturben (aproximadamente 700 μL).
4. Purificación del ARN total, incluidos los microARN
NOTA: Se utiliza un método de purificación de ARN total basado en columnas para obtener ARN total de alta calidad.
- Añadir un volumen igual de etanol (95%-100%) a la muestra de la sección 3.7, aproximadamente 700 μL, y mezclar a mano invirtiendo el tubo durante 10 s.
- Transfiera 700 μL de la mezcla a una columna insertada en un tubo de recolección, centrifugue y deseche el flujo.
- Vuelva a cargar la columna y repita el paso 4.2.
- Transfiera la columna a un nuevo tubo de recolección.
- Añadir 400 μL de tampón de prelavado a la columna y centrifugar. Deseche el flujo continuo y repita este paso.
- Añadir 700 μL de tampón de lavado a la columna y centrifugar durante 2 min.
- Transfiera la columna con cuidado a un tubo libre de nucleasa.
- Añadir 50 μL de agua libre de nucleasas directamente a la matriz de la columna y eluir el ARN por centrifugación. Preparar alícuotas de 10 μL utilizando tubos de microfugo de 200 μL.
- Coloque inmediatamente las alícuotas en hielo y use una de ellas para determinar la concentración y pureza del ARN.
- Prepare una alícuota de 5 μL de ARN total ajustada a 100 ng/μL para medir la integridad del ARN y la concentración de microARN.
- Conservar a -80 °C hasta su uso.
5. Determinación de la concentración, pureza e integridad del ARN de los adipocitos maduros; Ensayo de cuantificación de microARN
NOTA: Las determinaciones de concentración y pureza de ARN se realizan utilizando un espectrofotómetro UV-Vis; La integridad del ARN y la cuantificación de miARN se realizan utilizando un analizador de control de calidad de ARN.
- Lave el lector de muestras con agua de grado molecular y limpie.
- Cargue 2 μL de agua de elución (en blanco), cambie la configuración a ARN y haga clic en el botón En blanco .
- Cargue 2 μL de muestra y haga clic en el botón Medir .
- Una vez completada la lectura, registre las proporciones A260/A280 y A260/A230, así como la cantidad de ARN (ng/μL) (Figura 1A).
NOTA: El ARN con una relación OD260/OD280 y OD260/OD230 de alrededor de 2,0 se considera puro. - Mida el número de integridad del ARN (RIN) con un kit de integridad del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 1B).
NOTA: Un RIN = 10 corresponde a ARN intacto, mientras que un RIN ≤ 3.0 indica un ARN fuertemente degradado. Para microarrays de expresión o RT-qPCR, utilice ARN con RIN ≥ 6.0. - Utilice un pequeño kit de ARN para determinar la concentración y el porcentaje de microARN, siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 1C).
NOTA: Para evitar la sobreestimación de ARN pequeños y micro, utilice muestras de ARN con RIN ≥ 6.0.
6. Recuento y viabilidad de las células de la fracción vascular estromal
- Diluir 10 μL de suspensión celular SVF (sección 2.24) en 90 μL de solución de azul de tripano al 0,4% (dilución final 1:10) y aplicar 10 μL a un hemocitómetro estándar.
- Cuente las células viables cuidadosamente, excluyendo las células muertas, en cuatro cuadrados en la esquina de la cámara de conteo.
- Determinar la concentración celular presente en la suspensión original: Concentración celular = Recuento total de células/4 x factor de dilución (10) x 10.000 = Células/mL
- Para calcular el rendimiento celular (células por gramo de tejido) obtenido, multiplique la concentración celular por el volumen total de la muestra original (en ml) y divida por el peso del tejido digerido (en gramos).
- Evalúe la viabilidad celular como el porcentaje de células vivas de la siguiente manera: % de viabilidad = (número de células viables / número total de células) x 100.
7. Caracterización de subconjuntos de macrófagos a partir de la fracción vascular estromal
- Transferir un total de 1 x 106 células SVF/ml a un tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo de 5 ml para citometría de flujo y células de pellets por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 °C.
- Agite cuidadosamente el gránulo y vuelva a suspender las células en 100 μL de 1x PBS en RT.
- Añadir la concentración óptima pretitulada de cada anticuerpo monoclonal conjugado con fluorocromo específico para un antígeno de superficie celular; mezclar suavemente e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a RT.
- Añadir un exceso de frío 1x PBS (≈ 1 mL) y centrifugar la SVF a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche los sobrenadantes rápidamente por decantación. Tenga cuidado de no alterar el pellet.
- Añadir 500 μL de solución de lisado 1x e incubar 15 min a RT, protegiendo los tubos de la luz directa.
- Retirar la solución después de la centrifugación a 400 x g durante 5 min a 4 °C y almacenar a 2-8 °C en la oscuridad hasta la adquisición de datos.
- Vórtice las células a fondo a baja velocidad para reducir la agregación antes de adquirirlas.
- Vuelva a suspender el gránulo de SVF en 5 ml de líquido de vaina en RT y, posteriormente, filtre a través de tres capas de gasa en un nuevo tubo de ensayo de polipropileno de fondo redondo de 5 ml antes del análisis por citometría de flujo, para reducir la obstrucción de las líneas clasificadoras de células.
- Agite cada tubo brevemente antes del análisis.
- Adquirir datos de las muestras de interés. Para el análisis de flujo, cuente un mínimo de 10.000 eventos.
NOTA: Si utiliza un citómetro de flujo de clasificación celular, separe los macrófagos para su aplicación en estudios posteriores.
8. Estrategia de compuerta
- Trace la altura o el ancho contra el área de dispersión directa (FSC) para determinar la población de singletes (Figura 2A).
- Seleccione celdas que trazan el área de dispersión lateral (SSC) contra FSC, descartando los desechos celulares (Figura 2B).
- A partir de las células seleccionadas, identifique las poblaciones que expresan CD45 como células hematopoyéticas (Figura 2C) y las células CD45/CD14 doble positivas como macrófagos (Figura 2D).
- A partir de macrófagos CD45+/CD14+, detectar células HLA-DR negativas y positivas (Figura 2E).
NOTA: Incluya los controles de compensación para el panel de anticuerpos y ajuste la superposición espectral en un citómetro de flujo multicolor adecuado para el panel. Realizamos análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro equipado con tres láseres (láser violeta de 405 nm, láser azul de 488 nm y láser rojo de 640 nm) y detectores para los fluorocromos indicados.
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Representative Results
Este protocolo describe un método enzimático que utiliza la digestión de colagenasa seguida de centrifugación diferencial para aislar, en un solo proceso, adipocitos maduros viables y células SVF de biopsias de IVA obtenidas de gestantes sanas después de una omentectomía parcial. En este caso, utilizamos los adipocitos para la extracción de ARN y el SVF para el fenotipado de macrófagos.
El protocolo de extracción de ARN permitió obtener ARN con una pureza adecuada, alta integridad y microARN a partir de adipocitos maduros (Figura 1). La integridad del ARN evaluada por un analizador de control de calidad de ARN dio como resultado valores excelentes para las muestras de adipocitos aisladas con el protocolo (RIN = 9,7).
El total de células nucleadas presentes en VAT-SVF fue de aproximadamente 2,8 x 106 células/gramo de VAT (2,8 x 106 ± 1,7 x 106), con un 64% de viabilidad (63,9 ± 2,0) utilizando la prueba de exclusión de azul de tripano. Las células SVF se marcaron con anticuerpos primarios conjugados con fluoróforos para identificar y caracterizar los macrófagos AT mediante análisis de clasificación celular activado por fluorescencia. El análisis de citometría de flujo genera gráficos que muestran diferentes poblaciones celulares basadas en marcadores celulares (Figura 2). Inicialmente, al trazar el área de dispersión directa (FSC-A) frente a la altura de dispersión directa (FSC-H), los agregados de celdas se eliminaron fácilmente del análisis (Figura 2A). A continuación, se excluyeron los restos celulares mediante la compuerta de las células en función del tamaño y la complejidad correctos utilizando el área de dispersión directa (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) (Figura 2B). A continuación, para analizar los macrófagos, no fue necesario excluir otras células inmunitarias. En primer lugar, se seleccionaron células de linaje monocitos/macrófagos mediante el uso de marcadores CD45 y CD14 (Figura 2C,D). Posteriormente, se separaron las células doble positivas CD45/CD14 en función de la expresión del marcador de macrófagos HLA-DR, donde se identificaron dos subconjuntos de macrófagos: HLA-DR- y HLA-DR+ (Figura 2E).
Figura 1: Control de calidad del ARN de adipocitos maduros. (A) Concentración de ARN, relación 260/280 y 260/230; (B) Análisis de integridad. El electroferograma, la imagen en gel y el número de integridad del ARN se obtuvieron utilizando un analizador de control de calidad de ARN y un kit de análisis de ARN; (C) cuantificación de microARN. El electroferograma, la imagen en gel y el porcentaje de microARN se obtuvieron utilizando un analizador de control de calidad de ARN y un pequeño kit de ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de macrófagos a partir de tejido adiposo visceral. Gráficos representativos de citometría de flujo de macrófagos de la fracción vascular estromal aislados de tejido adiposo visceral recolectados durante una cesárea mediante digestión de colagenasa. (A) Identificación de singletes utilizando una primera puerta de área de dispersión directa (FSC-A) frente a FSC de altura (FSC-H) para eliminar dobletes. (B) Se utilizó una segunda compuerta de área de dispersión frontal (FSC-A) frente a área de dispersión lateral (SSC-A) para eliminar los escombros en función del tamaño y la densidad. (C,D) SSC-A frente a la puerta CD45 identificó células de origen hematopoyético, y SSC-A frente a la puerta CD14 identificó macrófagos. (E) El total de macrófagos CD45+/CD14+ se comprimió en función del marcador HLA-DR y se identificaron dos subconjuntos de macrófagos: HLA-DR- y HLA-DR+. Los gráficos ilustran datos representativos de sujetos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El IVA juega un papel crucial en la regulación metabólica y la inflamación. El creciente interés en el papel de los adipocitos y las células inmunitarias en la inflamación crónica asociada a la obesidad ha llevado al desarrollo de diferentes técnicas para separar la FVS y las células grasas presentes en la TA. Sin embargo, la mayoría de las técnicas no permiten obtener estos dos conjuntos diferentes de células viables para aplicaciones posteriores a partir de la misma biopsia de VAT en un solo procedimiento, lo que podría ser crucial para los estudios sobre las interacciones entre los adipocitos y las células SVF. Por lo tanto, implementamos este protocolo que proporciona una descripción detallada para aislar adipocitos maduros viables y células SVF presentes en una biopsia de VAT. Difiere de los informes anteriores en el tiempo de digestión de los tejidos y la concentración de colagenasa, así como en el tiempo y la velocidad de centrifugación para la separación celular, lo que permite rendimientos adecuados de ARN de adipocitos y una caracterización detallada de los subconjuntos de macrófagos.
Se han propuesto una gran cantidad de técnicas de aislamiento enzimático y no enzimático para células derivadas de AT, con diferentes efectos sobre las características biológicas y propiedades funcionales de las células aisladas 17,21,22,23,24, por lo que es necesario elegir la estrategia más adecuada según el objetivo perseguido. Con frecuencia, el aislamiento de adipocitos maduros y de la FVS del tejido adiposo se logra utilizando enzimas de disociación tisular 25,26,27. A pesar de que se pueden utilizar diferentes enzimas para disociar el TA, la digestión enzimática con colagenasa permanece como el estándar de oro para digerir este tejido27,28. Dado que el VAT está compuesto por una matriz blanda, se puede digerir fácilmente con colagenasa tipo II. Este procedimiento evita la disociación inadecuada de los tejidos, ya que esta enzima altera el colágeno nativo de la matriz extracelular, liberando muchas más células del estroma fibroso, con un impacto insignificante en la viabilidad celular, el rendimiento celular y la expresión de diferenciación de conglomerados 19,27,28,29.
En cuanto a la digestión enzimática, también es esencial tener en cuenta la concentración de enzimas, el período de digestión, así como los parámetros de centrifugación para diseñar un protocolo adecuado para el aislamiento de adipocitos maduros y células SVF del VAT, ya que estos factores pueden afectar el fenotipo celular, la recuperación y la viabilidad en la suspensión celular final27,29. El uso de colagenasa como enzima proteolítica es ideal a baja concentración [rango 0,075% a 0,3% (p/v)], con un período de incubación menor a 2 h, por lo que las características fenotípicas y funcionales de la FVS, como la tasa de proliferación, la capacidad de diferenciación y la frecuencia de linajes celulares específicos, permanecen inalteradas30,31. Utilizamos un período máximo de digestión de 60 min y colagenasa al 0,25%, reduciendo la concentración y el tiempo de exposición a la colagenasa para obtener un impacto insignificante en la viabilidad celular y en la expresión de los marcadores de superficie de las células SVF, evitando resultados sesgados en el análisis de citometría de flujo. También incluimos pasos de centrifugación suaves y tiempos de centrifugación más cortos de 200 g/5 min para mejorar la recuperación celular durante la separación de células grasas, lo que representa una ventaja para el protocolo, ya que los períodos de centrifugación largos e intensos [por encima de 400 g/1 min] aumentan la muerte de los adipocitos, limitando el rendimiento celular 32,33,34. La recuperación celular de la FVS lograda a través del protocolo de digestión basado en colagenasa es similar a los rendimientos típicos de 2-6 x 106 células/g AT reportados en la literatura, mientras que la viabilidad de la FVS de 63,9 ± 2,0 es moderadamente inferior al umbral mínimo propuesto del 70%-80% para este tipo de células 35,36,37,38. Es probable que esto se deba a que no utilizamos medios de cultivo para resuspender las células SVF como protocolos estándar, ya que caracterizamos la población de macrófagos a través de sus marcadores de superficie, y se ha reportado que estas células exhiben una notable plasticidad en respuesta a las condiciones ambientales, incluso cambiando su fenotipo 39,40,41.
Además, también es importante mencionar que las gestantes incluidas en este protocolo como donantes de IVA estaban sanas, sin evidencia clínica de comorbilidades metabólicas, ganancia de peso normal durante el embarazo, edad promedio de 20 a 25 años e Índice de Masa Corporal pregestacional normal (IMC 18,5-24,9 kg/m2; n = 7), debido a que algunos autores han descrito que los diferentes donantes, edad, IMC y sexo o etnia influyen en el número de células y en la expresión de los marcadores de superficie del SFV 42,43,44.
Por otro lado, el análisis del perfil de expresión génica requiere cantidades razonables de ARN intacto, pero su aislamiento de los adipocitos maduros es particularmente difícil porque estas células tienen un mayor contenido de lípidos y, en algunos casos, el número de células es bajo 45,46,47,48. Optimizamos un procedimiento de aislamiento de ARN de adipocitos maduros basado en un método estándar de isotiocianato/fenolde guanidina 49,50, implementando pasos sencillos que permiten eliminar lípidos y restos celulares. Después de la preparación de la muestra, la extracción de ARN basada en columna nos permite obtener un ARN libre de ADN de alta calidad, incluidos los microARN, lo cual es bastante inusual para las muestras de AT. La verificación de la pureza y la integridad de estos ARN a través de un analizador de control de calidad de ARN basado en microfluídica garantiza que la calidad del ARN aislado sea adecuada para aplicaciones posteriores, como ensayos de RT-qPCR y microarrays de expresión.
Además de las ventajas mencionadas anteriormente, la digestión de AT mediante colagenasa permite liberar simultáneamente adipocitos y células inmunitarias residentes, manteniendo la integridad de los receptores de la superficie celular; este es un hecho importante durante el aislamiento de células SVF para obtener datos de citometría de flujo confiables e interpretables27. Además, las células aisladas de tejidos cargados de lípidos, como el VAT, tienden a ser más propensas a la agregación, lo que reduce el rendimiento celular clasificado y aumenta la autofluorescencia51. En el protocolo, la eliminación de estos agregados celulares por filtración a través de tres capas de gasa antes de la clasificación y su exclusión con la estrategia de compuerta descrita, minimizan la fluorescencia de fondo, mejorando la calidad de la muestra para la clasificación celular.
Se han realizado estudios previos para identificar las células presentes en la FVS utilizando un único conjunto de marcadores de CD característicos de estas células 52,53,54,55,56,57,58,59. Para una caracterización más profunda de los subtipos de macrófagos en la SVF de VAT, categorizamos estas células por la expresión de marcadores específicos de la superficie celular. De acuerdo con la expresión de los marcadores CD45 y CD14 utilizados para identificar las células de linaje monocitos/macrófagos en VAT60, encontramos que este tejido está compuesto por una población típica de macrófagos CD45+CD14+ de origen hematopoyético. Utilizando el mismo protocolo, en un estudio previo pudimos caracterizar poblaciones de macrófagos M1 (CD11c) y M2 (CD163 y CD206)20.
El fenotipado de macrófagos dentro de la TA se ha categorizado como un espectro que va desde macrófagos proinflamatorios (M1 activado clásicamente) hasta macrófagos antiinflamatorios (M2 activado alternativamente) según la presencia de diferentes marcadores de activación en su superficie61,62. El marcador de macrófagos HLA-DR refleja el grado de activación de macrófagos63,64, y se incorporó en el protocolo para establecer el fenotipo M1 o M2: las poblaciones de macrófagos que expresan HLA-DR+ son inflamatorias y HLA-DR- representan macrófagos no inflamatorios. Así, con base en la expresión del marcador HLA-DR, se definieron dos subconjuntos de macrófagos: CD45+CD14+HLA-DR- y CD45+CD14+HLA-DR+, que se originan a partir de monocitos circulantes y más conocidos como macrófagos derivados de monocitos dentro del tejido adiposo65,66.
Además, cuantificamos CD11c (marcador M1), así como CD163 y CD206 (marcador M2) en cada subtipo de macrófagos, determinando que los macrófagos AT muestran todos los marcadores de activación evaluados en la superficie de su membrana, lo que demuestra que los macrófagos presentes en el IVA de las mujeres embarazadas tienen características más complejas que las descritas para las clasificaciones excesivamente simplificadas de las poblaciones de macrófagos M1 y M2. Por lo tanto, la aplicación de citometría de flujo básica con panel de anticuerpos multicolor y activación celular estricta permite identificar y caracterizar los macrófagos del grupo heterogéneo de células en la SVF. El fenotipado refinado de macrófagos obtenido con el protocolo puede ser útil en estudios realizados para dilucidar los cambios dinámicos de las poblaciones de macrófagos en el AT que conducen a la alteración de la homeostasis del AT.
Aunque este protocolo fue diseñado para caracterizar macrófagos VAT, los ajustes realizados en el panel de anticuerpos podrían ampliar sus aplicaciones para facilitar la clasificación de otras células inmunitarias que residen en el AT, ya que se dispone de numerosos anticuerpos fluorescentes para identificar marcadores específicos de diferente linaje. Además, el método permite que las poblaciones celulares purificadas por clasificación celular puedan ser utilizadas para análisis post-sort como la extracción de ADN/ARN/proteínas o tratamientos ex vivo , obteniendo las células directamente en un medio apropiado con técnicas de esterilidad.
En resumen, consideramos que el protocolo aquí detallado representa el equilibrio más eficiente entre tiempo, recursos, rendimiento celular y viabilidad celular, además de ser altamente eficiente para la extracción de ARN y miARN de las células grasas, y para la caracterización de la población de macrófagos en TA.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Instituto Nacional de Perinatología (números de subvención: 3300-11402-01-575-17 y 212250-3210-21002-06-15) y CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (subvención número 2015-3-2-61661).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | - |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | - | - | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | - | - | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | - |
| Manual cell counter | - | - | - |
| Mayo dissecting scisors | - | - | Stainless steel |
| Microcentrifuge | - | - | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| Orbital shaker | - | - | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | - | - | - |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | - | - | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | - | - | - |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | - | - | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
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