Summary
이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.
Abstract
내장 지방 조직(VAT)은 주로 성숙한 지방 세포와 기질 혈관 분획(SVF) 세포로 구성된 활성 대사 기관으로, 대사, 호르몬 및 면역 과정을 조절하는 다양한 생체 활성 분자를 방출합니다. 현재로서는 이러한 과정이 지방 조직 내에서 어떻게 조절되는지는 불분명합니다. 따라서 지방 조직의 병태생리학에 대한 각 세포 집단의 기여도를 평가하는 방법의 개발이 중요합니다. 이 프로토콜은 분리 단계를 설명하고 콜라겐분해효소 효소 분해 기술을 사용하여 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포 및 SVF를 효율적으로 분리하는 데 필요한 문제 해결 지침을 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 대식세포 서브세트를 식별하고 유전자 발현 연구를 위한 성숙한 지방 세포 RNA 분리를 수행하도록 최적화되어 있어 이러한 세포 집단 간의 상호 작용을 해부하는 연구를 수행할 수 있습니다. 간단히 말해서, VAT 생검은 세척하고, 기계적으로 다지고, 소화되어 단일 세포 현탁액을 생성합니다. 원심분리 후, 성숙한 지방세포는 SVF 펠릿에서 부유선광에 의해 분리됩니다. RNA 추출 프로토콜은 다운스트림 발현 분석을 위해 지방세포에서 총 RNA(miRNA 포함)의 높은 수율을 보장합니다. 동시에 SVF 세포는 유세포 분석을 통해 대식세포 하위 집합(전염증 및 항염증 표현형)을 특성화하는 데 사용됩니다.
Introduction
백색 지방 조직은 지방 세포 또는 지방 세포뿐만 아니라 대식세포, 조절 T 세포(Tregs)와 같은 기타 면역 세포, 호산구, 지방세포, 섬유아세포로 구성된 이질적인 세포 집단을 포함하는 기질 혈관 분획(SVF)으로 알려진 비지방 세포 분획으로 구성되어 있으며 혈관 및 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다 1,2. 지방 조직(AT)은 이제 다른 세포에서 생성되어 조직으로 방출되는 아디포카인, 사이토카인 및 마이크로RNA를 통해 대사 및 염증과 관련된 생리적 과정을 조절하는 기관으로 간주되며 자가분비, 파라크린 및 내분비 효과 3,4. 인간의 경우 백색 지방 조직은 피하 지방 조직(SAT)과 내장 지방 조직(VAT)으로 구성되며 중요한 해부학적, 분자적, 세포적, 생리학적 차이가 있습니다 2,5. SAT는 인간 AT의 최대 80%를 차지하는 반면, VAT는 주로 장간막과 난막에 있는 복강 내에 위치하며 신진대사가 더 활발하다6. 또한 VAT는 체중, 인슐린 감수성, 지질 대사 및 염증에 상당한 영향을 미치는 매개체를 분비하는 내분비 기관입니다. 결과적으로, 부가가치세 누적은 복부 비만과 제2형 당뇨병, 대사 증후군, 고혈압 및 심혈관 질환 위험과 같은 비만 관련 질병을 유발하며, 이는 비만 관련 사망률을 더 잘 예측할 수 있는 지표이다 6,7,8,9.
항상성 상태에서는 지방세포, 대식세포 및 기타 면역세포가 협력하여 항염증 매개체의 분비를 통해 VAT 대사를 유지한다10. 그러나 과도한 VAT 확장은 활성화된 T 세포, NK 세포 및 대식세포의 모집을 촉진합니다. 실제로, 희박한 VAT에서 대식세포의 비율은 5%인 반면, 비만에서는 이 비율이 50%까지 상승하며, 대식세포가 항염증제에서 전염증성 표현형으로 분극되어 만성 염증 환경을 생성합니다10,11.
비만 팬데믹의 결과로, 지방세포 생물학, 후성유전학, 염증, 내분비 특성, 세포외 소포체와 같은 신흥 부위 등 다양한 VAT 연구 주제를 다루는 보고서가 놀라울 정도로 많이 나왔습니다 8,10,12,13. 그러나 VAT 환경은 지방세포와 상주 또는 도착하는 대식세포 간의 혼선에 의해 정의되지만, 대부분의 연구는 하나의 세포 집단에만 초점을 맞추었으며 VAT에서 이러한 세포의 상호 작용과 병태생리학적 결과에 대한 정보는 부족합니다11,14. 더욱이, AT에서 지방세포-대식세포 상호작용을 다루는 가치 있는 연구는 in vivo 프라이밍 조건 11,14,15가 결여된 세포주를 사용하여 수행되었다. VAT에서 이러한 세포의 상호 작용 또는 특정 기여도를 해부하기 위한 적절한 전략은 VAT 대사를 조절하는 생체 내 특성을 최대한 유사하게 반영하는 in vitro 분석을 수행하기 위해 동일한 지방 생검에서 두 세포 유형을 분리해야 합니다.
AT를 파괴하기 위한 기계적 힘에 기반한 비효소적 해리 방법은 최소한의 조작을 보장하지만, 이러한 방법은 효소 방법에 비해 세포 회수 효율이 낮고 세포 생존율이 낮고 더 많은 양의 조직이 필요하기 때문에 SVF 세포를 연구하는 것이 목적인 경우 사용할 수 없습니다16,17. 콜라겐분해효소를 이용한 효소 분해는 WAT18과 같은 섬유조직의 콜라겐 및 세포외 기질 단백질을 적절하게 소화할 수 있는 부드러운 방법이며, 트립신이 효과가 없거나 손상을 줄 때 자주 사용된다19. 이 프로토콜은 콜라겐분해효소 효소 분해 기술을 사용하여 단일 공정에서 인간 VAT 생검에서 생존 가능한 성숙 지방세포 및 SVF 세포를 효율적으로 분리하기 위한 근본적인 문제 해결 지침을 제공하며, 다운스트림 발현 애플리케이션을 위해 microRNA를 포함한 성숙한 지방세포에서 총 RNA의 높은 수율(양, 순도 및 무결성)을 보장하기 위한 정보를 제공합니다. 동시에, 프로토콜은 유세포 분석법(20)에 의한 추가 분석을 위해 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 SVF 세포에서 대식세포 하위 집합을 식별하도록 최적화되어 있습니다.
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Protocol
이 프로토콜은 Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15)의 IRB에 의해 승인되었습니다. 참여는 자발적이었으며, 등록된 모든 여성들은 정보에 입각한 동의서에 서명했다.
1. 내장 지방 조직 수집
- 분만 없이 단태 임신을 한 건강한 성인 여성의 제왕절개 중 부분 자궁 절제술을 통해 VAT 생검을 받습니다.
- 자궁을 폐쇄하고 지혈을 한 후, 더 큰 오멘텀을 확인하고 습식 찜질로 확장합니다. 노출된 AT는 VAT입니다.
- 가장 큰 혈관을 찾아 7 x 5cm의 가상의 선을 따라 더 큰 오멘텀 기저부까지 이동합니다.
- 혈관 구역을 식별하고 Kelly 겸자를 사용하여 VAT의 바깥쪽을 뚫습니다.
- Ochsner 집게를 사용하여 VAT가 뚫린 영역에서 근위부 및 원위부를 고정하고 Metzenbaum 가위를 사용하여 조직을 자릅니다.
- 블랙 실크 넘버 1로 더 큰 오멘텀을 묶습니다.
- Ochsner 겸자를 제거하고 지혈을 평가합니다.
- VAT 생검을 멸균 용기에 넣고 즉시 실험실로 운반합니다.
2. 내장 지방 조직의 효소 소화 및 성숙한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 세포의 분리
- VAT 생검의 무게를 측정하고 1x PBS pH 7.4로 헹굽니다.
- 4g의 VAT를 자르고 가위를 사용하여 해부 트레이에서 조직을 작은 조각으로 다집니다.
- 다진 VAT를 멸균 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 PBS 20mL를 추가한 다음 부드럽게 흔들어 과잉 적혈구를 제거합니다.
- PBS를 버리고 절차를 두 번 반복합니다.
- VAT를 새 멸균 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 25mL의 분해 용액(0.25% 콜라겐분해효소 유형 II, 5mM 포도당, PBS의 1.5% 알부민)을 추가합니다.
- 37°C에서 125 rpm의 오비탈 쉐이커에서 60분 동안 배양합니다.
- 3겹의 거즈를 통해 소화된 조직을 여과하여 새로운 멸균 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 4 °C에서 5분 동안 200 x g 의 원심분리기.
- 두 개의 상이 얻어지는데, 성숙한 지방 세포에 해당하는 상부 단계이고 SFV 세포는 펠릿에 남아 있습니다. 전사 피펫을 사용하여 성숙한 지방세포를 새로운 멸균 50mL 원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
- 차가운 PBS 20mL를 넣고 부드럽게 흔든 다음 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- PBS를 버리고 절차를 두 번 반복합니다.
- 이송 피펫을 사용하여 성숙한 지방세포를 1.5mL DNase-RNase가 없는 미세원심분리기 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
- 4°C에서 1분 동안 200 x g 으로 원심분리하고 P200 마이크로피펫을 사용하여 여분의 PBS를 제거합니다. 필요한 경우 이 단계를 반복합니다.
- 300μL의 성숙한 지방 세포 현탁액을 1.5mL DNase-RNase가 없는 마이크로 원심분리 튜브에 부드럽게 옮깁니다. 성숙한 지방세포는 RNA 추출까지 -80°C에서 보관합니다.
알림: 지방 세포는 펠릿을 형성하지 않습니다. - 지방 세포가 분리되면(2.9단계) SVF 펠릿을 튜브 바닥에 유지하면서 이송 피펫으로 대부분의 분해 용액을 흡인합니다.
- SVF 셀이 있는 펠릿을 이송 피펫을 사용하여 새로운 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 피펫팅을 위아래로 하여 20mL의 차가운 1x PBS에 재현탁하면서 셀 펠릿을 부드럽게 세척합니다.
- 800 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 후 디캔테이션을 통해 상층액을 빠르게 제거합니다.
- 2.17 및 2.18 단계를 반복하여 두 번째 세척을 수행하십시오.
- 실온(RT)과 평형을 이룬 적혈구 용해 완충액 5mL를 SVF 펠릿에 추가하고 반복적인 피펫팅으로 현탁시킵니다. 소용돌이치지 마십시오.
- 상온에서 5분간 배양하고 800 x g에서 5분간 원심분리합니다. 전사 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
- 용해 완충액을 중화하기 위해 차가운 1x PBS 10mL를 추가하고 세포 펠릿이 분해될 때까지 부드럽게 혼합합니다.
- 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 SVF 펠릿을 얻고 PBS를 버립니다. 튜브 바닥에 흰색 펠릿이 보여야 합니다.
- 반복적인 피펫팅을 통해 RT에서 5mL의 1x PBS에 세포를 재현탁시키고 3겹의 거즈를 통해 여과하여 새로운 50mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 그 후, 이 세포는 유세포 분석에 의한 대식세포 하위 집단 특성 분석에 사용됩니다.
3. 성숙한 지방세포에서 RNA 추출
- RNA 분해를 방지하기 위해 RNase 오염 제거 스프레이를 사용하여 깨끗한 영역을 준비합니다. RNA 절차용으로 예약된 피펫 세트를 사용하십시오. 사용된 모든 튜브와 팁은 RNase가 없어야 합니다.
- 성숙한 지방 세포 현탁액(섹션 2.14)을 -80°C에 보관한 경우 4°C에서 해동합니다.
알림: 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오. - 1,000μL의 산-구아니디늄-페놀 기반 시약을 첨가하여 세포를 용해하고 P1000 마이크로피펫과 완전히 혼합하여 균질화합니다.
- 핵단백질 복합체의 해리를 촉진하기 위해 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- RT에서 12,000 x g 에서 5분 동안 원심분리기 셀 용해물. 지방세포 지질에 해당하는 상부기(노란색), 핵산에 해당하는 중간기(분홍색), 펠릿(세포 파편)의 3단계가 얻어집니다.
- P200 마이크로피펫을 사용하여 지질층을 조심스럽게 제거합니다.
- 중간상을 새로운 2mL 튜브로 옮겨 지질 잔류물과 펠릿 교란(약 700μL)을 방지합니다.
4. microRNA를 포함한 전체 RNA의 정제
참고: 컬럼 기반 total RNA 정제 방법은 고품질 total RNA를 얻는 데 사용됩니다.
- 섹션 3.7의 샘플에 동일한 부피의 에탄올(95%–100%)(약 700μL)을 추가하고 튜브를 10초 동안 손으로 뒤집어 혼합합니다.
- 혼합물 700μL를 수집 튜브에 삽입된 컬럼으로 옮기고 원심분리한 후 플로우 스루를 폐기합니다.
- 열을 다시 로드하고 4.2단계를 반복합니다.
- 컬럼을 새 수집 튜브로 옮깁니다.
- 400μL의 사전 세척 버퍼를 컬럼과 원심분리기에 추가합니다. 플로우 스루를 버리고 이 단계를 반복합니다.
- 700μL의 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 2분 동안 원심분리합니다.
- 컬럼을 뉴클레아제가 없는 튜브에 조심스럽게 옮깁니다.
- 50μL의 뉴클레아제가 없는 물을 컬럼 매트릭스에 직접 추가하고 원심분리를 통해 RNA를 용리합니다. 200μL 미세분리 튜브를 사용하여 10μL의 부분 표본을 준비합니다.
- 즉시 부분 표본을 얼음 위에 놓고 그 중 하나를 사용하여 RNA 농도와 순도를 측정합니다.
- RNA 무결성 및 microRNA 농도를 측정하기 위해 100ng/μL로 조정된 총 RNA 5μL의 부분 표본을 준비합니다.
- 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
5. 성숙한 지방 세포 RNA 농도, 순도 및 무결성 측정; microRNA 정량 분석
참고: RNA 농도 및 순도 측정은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 수행됩니다. RNA 무결성 및 miRNA 정량화는 RNA 품질 관리 분석기를 사용하여 수행됩니다.
- 샘플 리더를 분자 등급의 물로 씻고 닦습니다.
- 2μL의 용출수(블랭크)를 로드하고 설정을 RNA로 변경한 다음 블랭크 버튼을 클릭합니다.
- 2 μL의 시료를 로드하고 측정 버튼을 클릭합니다.
- 판독이 완료되면 A260/A280 및 A260/A230 비율과 RNA 양(ng/μL)을 기록합니다(그림 1A).
참고: OD260/OD280 및 OD260/OD230 비율이 약 2.0인 RNA는 순수한 것으로 간주됩니다. - 제조업체의 지침에 따라 RNA 무결성 키트를 사용하여 RNA 무결성 번호(RIN)를 측정합니다(그림 1B).
참고: RIN =10은 원형(intact) RNA에 해당하고, RIN ≤ 3.0은 강하게 분해된 RNA를 나타냅니다. 발현 마이크로어레이 또는 RT-qPCR의 경우 RIN ≥ 6.0과 함께 RNA를 사용합니다. - 제조업체의 지침에 따라 소형 RNA 키트를 사용하여 microRNA의 농도와 비율을 측정합니다(그림 1C).
참고: small 및 micro RNA의 과대 평가를 피하려면 RIN ≥ 6.0의 RNA 샘플을 사용하십시오.
6. 기질 혈관 분획 세포의 수 및 생존력
- 10μL의 SVF 세포 현탁액(섹션 2.24)을 90μL의 0.4% 트리판 블루 용액(최종 희석 1:10)에 희석하고 표준 혈구분석기에 10μL를 적용합니다.
- 죽은 세포를 제외하고 계수 챔버 모서리에 있는 4개의 사각형으로 생존 가능한 세포를 주의 깊게 계산합니다.
- 원래 현탁액에 존재하는 세포 농도 측정: 세포 농도 = 총 세포 수/4 x 희석 계수 (10) x 10,000 = 세포/mL
- 얻어진 세포 수율(조직 그램당 세포)을 계산하려면 세포 농도에 원래의 총 샘플 부피(mL)를 곱하고 분해된 조직의 무게(그램)로 나눕니다.
- 세포 생존율을 살아있는 세포의 백분율로 평가합니다: % Viability = (Number of viable cells / Total number of cells) x 100.
7. 기질 혈관 분획에서 대식세포 subset의 특성화
- 4°C에서 5분 동안 800 x g에서 원심분리하여 유세포 분석 및 펠릿 세포를 위해 총 1 x 106 SVF 세포/mL를 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관으로 옮깁니다.
- 소용돌이를 조심스럽게 풀어 펠릿을 풀고 RT에서 1x PBS의 100μL에 세포를 재현탁시킵니다.
- 세포 표면 항원에 특이적인 각 형광 크롬 접합 단클론 항체의 사전 적정된 최적 농도를 추가합니다. 부드럽게 섞고 RT의 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다.
- 여분의 차가운 1x PBS(≈ 1mL)를 추가하고 SVF를 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 디캔테이션으로 상층액을 빠르게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 500μL의 1x 용해 용액을 추가하고 직사광선으로부터 튜브를 보호하면서 RT에서 15분 동안 배양합니다.
- 400 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 후 용액을 제거하고 데이터가 수집 될 때까지 어두운 곳에서 2-8 °C에 보관하십시오.
- 세포를 저속으로 완전히 소용돌이쳐 수집하기 전에 응집을 줄입니다.
- SVF 펠릿을 RT에서 5mL의 시스 유체에 재현탁시킨 다음 유세포 분석으로 분석하기 전에 3겹의 거즈를 통해 새로운 5mL 둥근 바닥 폴리프로필렌 시험관으로 여과하여 세포 분류기 라인의 막힘을 줄입니다.
- 분석하기 전에 각 튜브를 잠깐 소용돌이치십시오.
- 관심 있는 샘플에서 데이터를 수집합니다. 흐름 분석의 경우 최소 10,000개의 이벤트를 계산합니다.
참고: 세포 분류 유세포 분석기를 사용하는 경우 후속 연구에 적용할 수 있도록 대식세포를 분리하십시오.
8. 게이팅 전략
- 전방 산란(FSC) 영역에 대한 높이 또는 너비를 플로팅하여 단일항 모집단을 결정합니다(그림 2A).
- FSC에 대해 Side Scatter (SSC) 영역을 플로팅하는 세포를 선택하고 세포 파편을 버립니다(그림 2B).
- 선택된 세포에서 CD45를 조혈 세포로 발현하는 집단을 식별하고(그림 2C), CD45/CD14 이중 양성 세포를 대식세포로 식별합니다(그림 2D).
- CD45+/CD14+ 대식세포에서 HLA-DR 세포의 음성 및 양성 세포를 검출합니다(그림 2E).
NOTE: 항체 패널에 대한 보정 컨트롤을 포함하고 패널에 적합한 multicolor 유세포 분석기에서 스펙트럼 겹침을 조정합니다. 3개의 레이저(405nm 보라색 레이저, 488nm 청색 레이저, 640nm 적색 레이저)가 장착된 유세포분석기와 표시된 형광색소용 검출기를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 부분 자궁 절제술 후 건강한 임산부로부터 얻은 VAT 생검에서 단일 공정으로 생존 가능한 성숙 지방 세포 및 SVF 세포를 분리하기 위해 콜라겐분해효소 분해 후 차등 원심분리를 사용하는 효소 방법을 설명합니다. 이 경우 RNA 추출을 위해 지방세포를 사용하고 대식세포 표현형을 위해 SVF를 사용합니다.
RNA 추출 프로토콜을 통해 적절한 순도의 RNA와 성숙한 지방 세포에서 microRNA를 얻을 수 있습니다(그림 1). RNA 품질 관리 분석기로 평가한 RNA 무결성은 프로토콜(RIN = 9.7)로 분리한 지방 세포 샘플에 대해 우수한 값을 나타냈습니다.
VAT-SVF에 존재하는 유핵 세포의 총계는 약 2.8 x 106 cells/g의 VAT (2.8 x 106 ± 1.7 x 106)였으며, 트리판 블루 배제 테스트를 사용하여 64%의 생존율(63.9 ± 2.0)을 보였습니다. SVF 세포는 형광 활성화 세포 분류 분석으로 AT 대식세포를 식별하고 특성화하기 위해 형광단 접합 1차 항체로 표지되었습니다. 유세포 분석 분석은 세포 마커를 기반으로 다양한 세포 집단을 보여주는 플롯을 생성합니다(그림 2). 처음에는 전방 산란 면적(FSC-A)과 전방 산란 높이(FSC-H)를 플로팅하여 세포 응집체를 분석에서 쉽게 제거할 수 있었습니다(그림 2A). 그런 다음 전방 산란 영역(FSC-A) 및 측면 산란 영역(SSC-A)을 사용하여 정확한 크기와 복잡성을 기반으로 세포를 게이팅하여 세포 파편을 제외했습니다(그림 2B). 다음으로, 대식세포를 분석하기 위해 다른 면역세포를 배제할 필요가 없었다. 먼저, 단핵구/대식세포 계통 세포는 CD45 및 CD14 마커를 사용하여 선택되었습니다(그림 2C,D). 그 후, CD45/CD14 이중 양성 세포는 대식세포 마커 HLA-DR 발현에 기초하여 분리되었으며, 여기서 대식세포는 HLA-DR- 및 HLA-DR+ 의 두 가지 하위 집합을 식별했습니다(그림 2E).
그림 1: 성숙한 지방세포의 RNA 품질 관리. (A) RNA 농도, 260/280 및 260/230 비율; (B) 무결성 분석. Electropherogram, 겔 이미지 및 RNA 무결성 번호는 RNA 품질 관리 분석기 및 RNA 분석기 키트를 사용하여 획득했습니다. (C) microRNA 정량화. Electropherogram, 겔 이미지 및 microRNA 백분율은 RNA 품질 관리 분석기 및 소형 RNA 키트를 사용하여 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 내장 지방 조직에서 대식세포 식별. 콜라겐분해효소 소화를 사용하여 제왕절개 중에 수집된 내장 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획 대식세포의 대표적인 유세포 분석 플롯. (A) 이중항을 제거하기 위해 첫 번째 전방 산란 영역(FSC-A) 대 FSC 높이(FSC-H) 게이트를 사용하여 단일항을 식별합니다. (B) 두 번째 전방 산란 영역(FSC-A) 대 측면 산란 영역(SSC-A) 게이트를 사용하여 크기와 밀도에 따라 파편을 제거했습니다. (씨,디) SSC-A 대 CD45 게이트는 조혈 기원에서 세포를 식별했으며 SSC-A 대 CD14 게이트는 대식세포를 식별했습니다. (E) 총 CD45+/CD14+ 대식세포는 HLA-DR 마커를 기반으로 게이팅되었으며 대식세포의 두 하위 집합인 HLA-DR- 및 HLA-DR+가 확인되었습니다. 플롯은 개별 주제의 대표 데이터를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
VAT는 신진대사 조절과 염증에 중요한 역할을 합니다. 비만과 관련된 만성 염증에서 지방 세포와 면역 세포의 역할에 대한 관심이 증가함에 따라 AT에 존재하는 SVF와 지방 세포를 분리하는 다양한 기술이 개발되었습니다. 그러나 대부분의 기술에서는 단일 절차로 동일한 VAT 생검에서 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있는 이 두 가지 다른 세포 세트를 얻을 수 없으며, 이는 지방 세포와 SVF 세포 간의 상호 작용에 관한 연구에 중요할 수 있습니다. 따라서 VAT 생검에 존재하는 생존 가능한 성숙 지방 세포와 SVF 세포를 분리하기 위한 자세한 설명을 제공하는 이 프로토콜을 구현했습니다. 조직 소화 및 콜라겐분해효소 농도 시간뿐만 아니라 세포 분리를 위한 원심분리 시간 및 속도에서 이전 보고서와 다르기 때문에 적절한 지방 세포 RNA 수율과 상세한 대식세포 하위 집합 특성 분석이 가능합니다.
AT 유래 세포에 대한 많은 양의 효소 및 비효소적 분리 기술이 제안되어 왔으며, 분리된 세포의 생물학적 특성 및 기능적 특성에 상이한 영향을 미치므로(17,21,22,23,24), 추구하는 목표에 따라 가장 적절한 전략을 선택할 필요가 있다. 종종, 성숙한 지방 세포와 지방 조직으로부터의 SVF 분리는 조직 해리 효소25,26,27을 사용하여 달성된다. 다른 효소가 AT를 해리하기 위하여 이용될 수 있더라도, 교원질분해효소를 가진 효소 소화는 이 조직27,28를 소화하는 황금 기준으로 남아 있다. VAT는 부드러운 매트릭스로 구성되어 있기 때문에 콜라겐 분해 효소 II로 쉽게 소화 할 수 있습니다. 이 절차는 이 효소가 세포 생존력, 세포 수율 및 클러스터 분화 발현에 대한 무시할 수 있는 영향과 함께 섬유질 기질에서 더 많은 세포를 방출하는 세포외 기질 네이티브 콜라겐을 방해하기 때문에 부적절한 조직 해리를 방지합니다 19,27,28,29.
효소 분해 측면에서, 효소 농도, 분해 기간 및 원심분리 파라미터를 고려하여 VAT로부터 성숙한 지방 세포 및 SVF 세포 분리를 위한 적절한 프로토콜을 설계하는 것도 필수적인데, 이는 이러한 요인들이 최종 세포 현탁액에서 세포 표현형, 회수 및 생존력에 영향을 미칠 수 있기 때문이다27,29. 단백질 분해 효소로서의 콜라겐 분해 효소의 사용은 2 시간 미만의 배양 기간과 함께 저농도 [범위 0.075 % 0.3 % (w / v)]에서 이상적이므로 증식 속도, 분화 능력 및 특정 세포 계통의 빈도와 같은 표현형 및 기능적 SVF 특성은 변경되지 않은 상태로 유지됩니다30,31. 최대 소화 기간 60분과 0.25% 콜라겐분해효소를 사용하여 콜라겐분해효소 노출의 농도와 길이를 줄여 세포 생존율과 SVF 세포 표면 마커 발현에 미치는 영향을 무시하고 유세포 분석 분석에서 왜곡된 결과를 방지합니다. 또한 지방 세포 분리 중 세포 회복을 개선하기 위해 부드러운 원심분리 단계와 200g/5분의 짧은 원심분리 시간을 포함하며, 길고 강렬한 원심분리 기간[400g/1분 이상]은 지방 세포의 사멸을 증가시켜 세포 수율을 제한하기 때문에 프로토콜에 이점을 나타냅니다 32,33,34. 콜라겐 분해 효소 기반 분해 프로토콜을 통해 달성 된 SVF 세포 회수는 문헌에보고 된 2-6 x 106 cells/g AT의 일반적인 수율과 유사한 반면, 63.9 ± 2.0의 SVF 생존율은 이러한 유형의 세포에 대해 제안된 최소 임계값인 70%-80%보다 적당히 낮습니다 35,36,37,38. 이는 표면 마커를 통해 대식세포 집단을 특성화하기 때문에 SVF 세포를 표준 프로토콜로 재현탁하기 위해 배양 배지를 사용하지 않기 때문일 수 있으며, 이러한 세포는 환경 조건에 반응하여 현저한 가소성을 나타내며 표현형 39,40,41을 변경하기도 합니다.
또한, 부가가치세 기증자로 이 프로토콜에 포함된 임산부는 대사 동반 질환, 임신 중 정상적인 체중 증가, 평균 연령 20-25세 및 정상 임신 전 체질량 지수(BMI 18.5–24.9 kg/m2; n = 7), 일부 저자는 다른 기증자, 연령, BMI 및 성별 또는 민족이 세포 수에 영향을 미치고 SFV 표면 마커 42,43,44의 발현에 영향을 미친다고 기술했기 때문입니다.
반면에, 유전자 발현 프로파일 분석은 적당한 양의 온전한 RNA를 필요로 하지만, 이들 세포는 더 높은 지질 함량을 가지며 어떤 경우에는 세포 수가 45,46,47,48로 낮기 때문에 성숙한 지방 세포로부터의 분리가 특히 어렵습니다. 표준 구아니딘 이소티오시아네이트/페놀 분석법49,50을 기반으로 성숙한 지방세포에서 RNA 분리 절차를 최적화하여 지질과 세포 파편을 제거할 수 있는 쉬운 단계를 구현했습니다. 시료 전처리 후 컬럼 기반 RNA 추출을 통해 microRNA를 포함한 고품질 DNA가 없는 RNA를 얻을 수 있으며, 이는 AT 시료에서는 매우 드문 일입니다. 미세유체역학 기반 RNA 품질 관리 분석기를 통한 이러한 RNA의 순도 및 무결성 검증은 분리된 RNA 품질이 RT-qPCR 분석 및 발현 마이크로어레이와 같은 다운스트림 애플리케이션에 적합한지 확인합니다.
앞서 언급한 장점 외에도 콜라겐분해효소를 사용한 AT 분해는 지방세포와 상주 면역 세포를 동시에 방출하여 세포 표면 수용체의 무결성을 유지할 수 있습니다. 이것은 SVF 세포 분리 중에 신뢰할 수 있고 해석 가능한 유세포 분석 데이터를 얻기 위한 중요한 사실입니다27. 또한, VAT와 같은 지질 함유 조직에서 분리된 세포는 응집되기 쉬운 경향이 있어 분류된 세포 수율을 감소시키고 자가형광을 증가시킨다51. 프로토콜에서 분류하기 전에 3겹의 거즈를 통해 여과하여 이러한 세포 응집체를 제거하고 설명된 게이팅 전략으로 제외하면 배경 형광을 최소화하여 세포 분류를 위한 시료 품질을 개선할 수 있습니다.
이전 연구는 이러한 세포 52,53,54,55,56,57,58,59에 대한 단일 세트의 CD 마커 특성을 사용하여 SVF에 존재하는 세포를 식별하기 위해 수행되었습니다. VAT SVF에서 대식세포 아형에 대한 보다 심층적인 특성 분석을 위해 특정 세포 표면 마커의 발현에 따라 이러한 세포를 분류했습니다. VAT60에서 단핵구/대식세포 계통 세포를 식별하는 데 사용되는 CD45 및 CD14 마커 발현에 따르면, 이 조직은 조혈 기원의 전형적인 CD45+CD14+ 대식세포 집단으로 구성되어 있음을 발견했습니다. 동일한 프로토콜을 사용하여 이전 연구에서 M1(CD11c) 및 M2(CD163 및 CD206) 대식세포 집단을 특성화할 수 있었습니다20.
AT 내의 대식세포 표현형은 표면에 상이한 활성화 마커의 존재에 따라 전염증성 대식세포(고전적으로 활성화된-M1)에서 항염증성 대식세포(대안적으로 활성화된-M2)까지의 스펙트럼으로 분류되었다61,62. HLA-DR 대식세포 마커는 대식세포 활성화도63,64를 반영하며, M1 또는 M2 표현형을 확립하기 위한 프로토콜에 통합되었습니다: HLA-DR+를 발현하는 대식세포 집단은 염증성이고 HLA-DR-은 비염증성 대식세포를 나타냅니다. 따라서 HLA-DR 마커 발현에 기초하여 대식세포의 두 가지 하위 집합인 CD45+CD14+HLA-DR- 및 CD45+CD14+HLA-DR+를 정의했으며, 이는 순환 단핵구에서 유래하고 지방 조직 내에서 단핵구 유래 대식세포로 더 잘 알려져 있습니다(65,66).
또한, 각 대식세포 아형에서 CD11c(M1 마커)와 CD163 및 CD206(M2 마커)을 정량화하여 AT 대식세포가 막 표면에 평가된 모든 활성화 마커를 표시한다는 것을 확인했으며, 임산부의 VAT에 존재하는 대식세포가 M1 및 M2 대식세포 집단의 지나치게 단순화된 분류에 대해 설명된 것보다 더 복잡한 특성을 가지고 있음을 입증했습니다. 따라서 multicolor 항체 패널과 엄격한 cell gating을 사용하여 기본 유세포 분석을 적용하면 SVF의 이질적인 세포 풀에서 대식세포를 식별하고 특성화할 수 있습니다. 프로토콜로 얻은 정제된 대식세포 표현형은 AT 항상성의 교란을 유발하는 AT의 대식세포 집단의 동적 변화를 설명하기 위해 수행된 연구에 유용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 VAT 대식세포를 특성화하기 위해 설계되었지만, 수많은 형광 항체를 사용하여 다른 계통의 특정 마커를 식별할 수 있기 때문에 항체 패널에서 조정하면 AT에 상주하는 다른 면역 세포의 분류를 용이하게 하기 위해 응용 분야를 확장할 수 있습니다. 또한, 이 방법을 사용하면 세포 분류로 정제된 세포 집단을 DNA/RNA/단백질 추출 또는 생체 외 처리와 같은 분류 후 분석에 사용할 수 있으며, 무균 기술을 사용하여 세포를 적절한 배지에 직접 얻을 수 있습니다.
요약하면, 본 명세서에 상세히 기술된 프로토콜은 지방 세포로부터의 RNA 및 miRNA 추출, 그리고 AT에서의 대식세포 집단의 특성화에 매우 효율적일 뿐만 아니라, 시간, 자원, 세포 수율 및 세포 생존력 사이의 가장 효율적인 트레이드오프를 나타낸다고 생각한다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Instituto Nacional de Perinatologia(보조금 번호: 3300-11402-01-575-17 및 212250-3210-21002-06-15) 및 CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social(FOSISS)(보조금 번호 2015-3-2-61661)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 mL serological pipettes | Corning | CLS4101-50EA | Individually plastic wrapped |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-L-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 10 µL universal pipet tip | Axygen | T-300-R-S | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 1000 µL universal pipet tip | Axygen | T-1000-B-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 200 µL universal pipet tip | Axygen | T-200-Y-R | RNase, DNase free and nonpyrogenic |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | - |
| 2101 Bioanalyzer PC | Agilent | G2953CA | 2100 Expert Software pre-installed in PC |
| 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube | Corning | 352003 | Snap cap, sterile |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | CLS430828-100EA | Polipropilene, conical bottom and sterile |
| Acid-guanidinium-phenol based reagent | Zymo Research | R2050-1-200 | TRI Reagent or similar |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | - |
| Agilent Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | - |
| APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325620 | 0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14 |
| Baker | - | - | 250 ml, non sterile |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912-100G | Heat shock fraction, pH 5.2, ≥96% |
| Chip priming station | Agilent | 5065-9951 | - |
| Collagenase type II | Gibco | 17101-015 | Powder |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | Powder |
| Direct-zol RNA Miniprep | Zymo Research | R2051 | Supplied with 50 mL TRI reagen |
| Dissecting forceps | - | - | Steel, serrated jaws and round ends |
| Dissection tray | - | - | Stainless steel |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | 200 proof, for molecular biology |
| FACS Flow Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | - |
| FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | - |
| FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter | BD Biosciences | 648282 | - |
| FASCDiva Software | BD Biosciences | 642868 | Software v6.0 pre-installed |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | - |
| Manual cell counter | - | - | - |
| Mayo dissecting scisors | - | - | Stainless steel |
| Microcentrifuge | - | - | Adjustable temperature |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000LAPTOP | - |
| Orbital shaker | - | - | Adjustable temperature and speed |
| P10 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642040 | 1 to 10 μL |
| P1000 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642090 | 100 to 1000 μL |
| P2 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642010 | 0.2 to 2 μL |
| P200 variable volume micropipette | Thermo Scientific-Finnpipette | 4642080 | 20 to 200 μL |
| PCR tube storage rack | Axygen | R96PCRFSP | - |
| PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody | BioLegend | 307608 | 0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243 |
| PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody | BioLegend | 304016 | 0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130 |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Pipette controller | - | - | - |
| Red Blood Cells Lysis Buffer | Roche | 11 814 389 001 | For preferential lysis of red blood cells from human whole blood |
| Refrigerated centrifuge | - | - | Whit adapter for 50 mL conical tubes |
| Sterile Specimen container | - | - | - |
| Transfer pipette | Thermo Scientific-Samco | 204-1S | Sterile |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | 0.4% Solution |
| Tube racks | - | - | For different tube sizes |
| Vortex Mini Shaker | Cientifica SENNA | BV101 | - |
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