קסנופוס לאוויס הכנת תמצית ביצים ושיטות הדמיה חיות להדמיית ארגון ציטופלסמי דינמי
Summary
אנו מתארים שיטה להכנה והדמיה חיה של תמציות ציטופלסמיות לא מדוללות מביצי Xenopus laevis .
Abstract
תמציות הביצים של Xenopus laevis , המשמשות באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת, התגלו ככלי רב עוצמה המבוסס על הדמיה לחקר תופעות ציטופלסמיות, כגון ציטוקינזיס, היווצרות צירים מיטוטיים והרכבת הגרעין. בהתבסס על שיטות מוקדמות שדיימו תמציות קבועות שנדגמו בנקודות זמן דלילות, גישות אחרונות לתמציות חיות של תמונות באמצעות מיקרוסקופיה של קיטועי זמן, וחושפות תכונות דינמיות יותר עם רזולוציה טמפורלית משופרת. שיטות אלה דורשות בדרך כלל טיפולי שטח מתוחכמים של כלי ההדמיה. כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיה חיה של תמציות ביצים שאינן דורשות טיפול כימי בפני השטח. הוא פשוט ליישום ומשתמש בחומרים מתכלים מעבדתיים בייצור המוני להדמיה. אנו מתארים מערכת שיכולה לשמש הן למיקרוסקופיה רחבת שדה והן למיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא מיועד להדמיית תמציות בשדה דו-ממדי (דו-ממדי), אך ניתן להרחיבו בקלות להדמיה בתלת-ממד. הוא מתאים היטב לחקר היווצרות תבניות מרחביות בתוך הציטופלסמה. בעזרת נתונים מייצגים, אנו מדגימים את הארגון הדינמי הטיפוסי של מיקרוטובולים, גרעינים ומיטוכונדריה בתמציות אינטרפאזה שהוכנו בשיטה זו. נתוני תמונה אלה יכולים לספק מידע כמותי על דינמיקה ציטופלסמית וארגון מרחבי.
Introduction
הציטופלסמה מהווה את הנפח העיקרי של התא ויש לה ארגון מובחן. המרכיבים של הציטופלסמה האאוקריוטית יכולים להרכיב את עצמם למגוון רחב של מבנים מרחביים, כגון אסטרים מיקרוטובולים ומנגנון גולג’י, אשר בתורם מסודרים באופן דינמי ומתהפכים בהתאם לזהות התא ולמצבו הפיזיולוגי. הבנת הארגון המרחבי של הציטופלסמה והקשר שלה לתפקודים תאיים חשובה אפוא להבנת אופן הפעולה של התא. תמציות ביצים של Xenopus laevis שימשו באופן מסורתי למבחנים ביוכימיים בתפזורת 1,2,3,4,5,6,7,8, אך עבודה אחרונה מבססת אותן כמערכת הדמיה חיה רבת עוצמה למחקרים מכניסטיים של מבנים ציטופלסמיים ותפקודם התאי 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. תמציות לא מדוללות אלה משמרות מבנים ותפקודים רבים של הציטופלסמה, תוך שהן מאפשרות מניפולציות ישירות של תוכן ציטופלסמי שאינו ניתן להשגה במודלים קונבנציונליים מבוססי תאים19,20. זה הופך אותם לאידיאליים לאפיון תופעות ציטופלסמיות ולניתוח היסודות המכניסטיים שלהם.
שיטות קיימות להדמיה של תמציות דורשות שינויים כימיים בפני השטח, או ייצור של התקנים מיקרופלואידיים. שיטה אחת המבוססת על כיסוי דורשת פסיבציה של פוליאתילן גליקול (PEG) של כיסויי זכוכית21. שיטה מבוססת מיקרו-אמולסיה דורשת תצהיר אדים של טריכלורו(1H,1H,2H,2H-פרפלואורוקטיל)סילאן על משטחי זכוכית22,23. מערכות מבוססות מיקרופלואידיקה מאפשרות שליטה מדויקת בנפח, בגיאומטריה ובהרכב של טיפות החילוץ, אך דורשות מתקני מיקרו-פבריקציה מיוחדים11,12,24.
כאן אנו מציגים שיטה חלופית להדמיית תמציות ביצים קלה ליישום ומשתמשת בחומרים זמינים ובעלות נמוכה. זה כולל הכנת תא הדמיה עם שקופית וכיסוי מצופה בסרט אתילן פרופילן פלואוריד (FEP). התא יכול לשמש להדמיית תמציות עם מגוון מערכות מיקרוסקופיה, כולל סטריאוסקופים ומיקרוסקופים זקופים והפוכים. שיטה זו אינה דורשת טיפול כימי במשטחים תוך השגת בהירות אופטית דומה המתקבלת בשיטות קיימות מבוססות זכוכית שנדונו לעיל. הוא נועד לדמות שכבה של תמציות בעובי אחיד על פני שדה דו-ממדי, וניתן להרחיב אותו בקלות כדי לדמות נפח תלת-ממדי של תמציות. הוא מתאים היטב להדמיה בהילוך מהיר של התנהגות ציטופלסמית קולקטיבית על פני שדה ראייה גדול.
השתמשנו בתמציות ביצים שנעצרו על ידי אינטרפאזה כדי להדגים את שיטת ההדמיה שלנו. הכנת התמצית עוקבת אחר הפרוטוקול של דמינג וקורנבלות’19. בקצרה, ביצים שנעצרו באופן טבעי במטאפאזה של מיוזה II נמעכות על ידי ספין במהירות נמוכה. ספין זה משחרר את הציטופלסמה ממעצר מיוטי ומאפשר לתמצית להמשיך לאינטרפאזה. בדרך כלל, ציטוכלזין B מתווסף לפני ספין הריסוק כדי לעכב היווצרות F-אקטין. עם זאת, ניתן להשמיט אותו אם רוצים F-actin. ציקלוהקסימיד מתווסף גם לפני ספין הריסוק כדי למנוע מתמצית האינטרפאזה להיכנס למיטוזה הבאה. התמציות ממוקמות לאחר מכן בתאי ההדמיה הנ”ל ומונחות על מיקרוסקופ. לבסוף, תמונות מתועדות לאורך זמן במרווחי זמן מוגדרים על ידי מצלמה המחוברת למיקרוסקופ, ומייצרות סדרות תמונות בהילוך מהיר הלוכדות את ההתנהגות הדינמית של התמצית בשדה דו-ממדי.
Protocol
Representative Results
Discussion
תמציות הביצים של Xenopus laevis התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקרים מבוססי הדמיה של מבנים תת-תאיים שונים 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 וארגון ציטופלסמי בכללותו<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לג’יי קמנץ, י’ צ’ן וו’ י’ סי הואנג על הערותיהם על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM110564, P50 GM107615 ו- R35 GM131792) שהוענקו לג’יימס א. פרל הבן.
Materials
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22×22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54 (3), 423-431 (1988).
- Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle. EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).
- Wu, J. Q., et al. PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation. Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).
- Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2. Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).
- Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis. Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47 (4), 577-587 (1986).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220 (4598), 719-721 (1983).
- Cheng, X., Ferrell, J. E. Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts. Science. 366 (6465), 631-637 (2019).
- Nguyen, P. A., et al. Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system. Science. 346 (6206), 244-247 (2014).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Hazel, J., et al. Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling. Science. 342 (6160), 853-856 (2013).
- Brownlee, C., Heald, R. Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling. Cell. 176 (4), 805-815 (2019).
- Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters. Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).
- Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles. Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).
- Mitchison, T. J., et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles. Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).
- Mitchison, T. J., et al. Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).
- Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. Real time observation of anaphase in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).
- Deming, P., Kornbluth, S. Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system. Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).
- Field, C. M., Mitchison, T. J. Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Guan, Y., et al. A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells. Elife. 7, (2018).
- Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts. Journal of Visualized Experiments. (139), e58240 (2018).
- Oakey, J., Gatlin, J. C. Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Smythe, C., Newport, J. W. Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts. Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).
- Field, C. M., et al. Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos. Journal of Cell Science. 124, 2086-2095 (2011).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle. Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).
- Chang, J. B., Ferrell, J. E. Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).
- Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells. Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).
- Mochida, S., Hunt, T. Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase. Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).
- Heald, R., et al. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).
- Helmke, K. J., Heald, R. TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).
- Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro. Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).
- Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 62 (3), 579-589 (1990).
- Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro. Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).
- Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).
- Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. Xenopus egg cytoplasm with intact actin. Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).
- Good, M. C., Heald, R. Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
- Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis. Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).
