Conservazione della fertilità attraverso la vitrificazione degli ovociti: prospettive cliniche e di laboratorio

Summary

La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali. Adeguate strategie cliniche e di laboratorio garantiscono la massima efficacia, efficienza e sicurezza dei trattamenti di conservazione della fertilità.

Abstract

Preservare la fertilità femminile è fondamentale in un sistema sanitario multifunzionale che si prende cura della futura qualità della vita dei pazienti. La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche. Le principali indicazioni mediche sono le malattie oncologiche, le malattie ginecologiche come l’endometriosi grave, le malattie sistemiche che compromettono la riserva ovarica e le condizioni genetiche che comportano la menopausa precoce. Questo documento descrive l’intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull’evidenza. Inoltre, si concentra sull’efficacia della procedura e descrive le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di prelievo degli ovociti, denudazione e vitrificazione sono state dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l’efficacia, l’efficienza e la sicurezza.

Introduction

Lo sviluppo e l’implementazione di un efficiente programma di crioconservazione per gli ovociti umani è stato un passo avanti significativo nella medicina riproduttiva. Secondo recenti evidenze, la vitrificazione è la strategia più efficace per crioconservare gli ovociti della metafase II (MII), in quanto si traduce in tassi di sopravvivenza statisticamente più elevati rispetto al congelamento lento, indipendentemente dalla popolazione di pazienti (pazienti infertili o programma di donazione di ovociti)^1,2,3. I notevoli risultati della vitrificazione degli ovociti hanno portato i comitati di pratica dell’American Society for Reproductive Medicine (ASRM) e della Society for Assisted Reproductive Technology (SART) a dichiarare questa tecnica come la più efficace per la conservazione elettiva della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche^4,5,6. Le indicazioni mediche per la conservazione della fertilità includono (i) il cancro e le malattie autoimmuni che richiedono terapie⁷ come la radioterapia, la chemioterapia citotossica e la terapia endocrina (il cui effetto dannoso sulla riserva ovarica è associato all’età materna, nonché al tipo e alla dose del trattamento); (ii) malattie ovariche che richiedono un intervento chirurgico ripetuto o radicale (come l’endometriosi)⁸; e (iii) condizioni genetiche (ad esempio, X-fragile) o insufficienza ovarica prematura. Inoltre, la conservazione della fertilità è diventata un’opzione preziosa per tutte le donne che non hanno raggiunto il loro obiettivo genitoriale per motivi non medici (noto anche come congelamento sociale).

Indipendentemente dall’indicazione per la conservazione della fertilità e secondo le principali linee guida internazionali sulla conservazione della fertilità, tutti i pazienti disposti a vetrificare i loro ovociti dovrebbero ricevere una consulenza appropriata per essere informati sulle loro realistiche possibilità di successo, i costi, i rischi e le limitazioni della procedura^{9,10,11,12,13}. Ancora più importante, dovrebbe essere chiaro che la vitrificazione di una coorte di ovociti MII non garantisce una gravidanza, ma che offre una maggiore possibilità di successo per il futuro trattamento di fecondazione in vitro (FIV), se necessario¹⁴. A questo proposito, l’età della donna al momento della vitrificazione degli ovociti è sicuramente il fattore limitante¹⁵ più importante in quanto l’età materna avanzata (AMA; >35 anni) è la causa principale dell’infertilità femminile^16. Oltre a una progressiva riduzione della riserva ovarica, l’AMA è associata a una compromissione della competenza degli ovociti a causa di percorsi fisiologici difettosi come il metabolismo, la regolazione epigenetica, i checkpoint del ciclo cellulare e la segregazione meiotica¹⁷. Pertanto, il numero ragionevole di uova da vetrificare dipende principalmente dall’età materna. Nelle donne di età inferiore ai 36 anni, sono necessari almeno 8-10 ovociti MII¹⁸ per massimizzare le possibilità di successo. In generale, maggiore è il numero di ovociti vitrificati, maggiore è la probabilità di successo. Pertanto, adattare la stimolazione ovarica in base ai marcatori della riserva ovarica come i livelli di ormone anti-Mülleriano (AMH) o la conta dei follicoli antrali (AFC) è fondamentale per sfruttare appieno la riserva ovarica nel più breve tempo possibile.

La sicurezza dell’intera procedura è l’altra questione chiave quando si arruolano pazienti per la conservazione della fertilità. I medici dovrebbero impiegare le migliori strategie per ridurre al minimo i rischi e prevenire la sindrome da iperstimolazione (i) ovarica (OHSS) utilizzando approcci sicuri come il protocollo antagonista dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) seguito da un trigger agonista GnRH¹⁹ e (ii) i rischi remoti, ma possibili, di sanguinamento peritoneale, lesioni alle strutture pelviche (uretere, intestino, appendice, nervi) o infezione pelvica durante il recupero degli ovociti. Infine, (iii) i regimi tradizionali per la stimolazione sono associati all’estradiolo sierico soprafisiologico e, pertanto, non sono raccomandati nelle malattie sensibili agli estrogeni come il cancro al seno. I protocolli che coinvolgono inibitori dell’aromatasi (come letrozolo o tamoxifene) sono più adatti in questi casi^20,21. In laboratorio, il protocollo più diffuso per la vitrificazione degli ovociti è ancora quello descritto per la prima volta da Kuwayama e colleghi^2,23,che consiste in una procedura graduale che prevede l’aggiunta graduale di crioprotezioni (CPA). Nella prima fase (equilibrio/disidratazione), gli ovociti sono esposti in una soluzione di CPA contenente il 7,5% v/v di glicole etilenico e il 7,5% v/v dimetilsolfossido (DMSO), mentre nella seconda fase gli ovociti vengono spostati in una soluzione di vetrificazione con 15% v/v etilenglicole e 15% v/v DMSO, più 0,5 mol/L saccarosio. Dopo una breve incubazione nel mezzo della vitrificazione, gli ovociti possono essere collocati in criodevice aperte appositamente progettate e infine immersi in azoto liquido a -196 °C per essere conservati fino all’uso.

Qui, l’intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità è stato descritto (i) delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull’evidenza, (ii) concentrandosi sul rapporto costo-efficacia della procedura e (iii) descrivendo le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di recupero degli ovociti, denudazione e vitrificazione saranno dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l’efficacia, l’efficienza e la sicurezza. Poiché esistono altri protocolli o adattamenti di questo protocollo in letteratura, i risultati rappresentativi e le sezioni di discussione di questo manoscritto si applicano solo a questa procedura.

Protocol

1. Work-up e consulenza clinica NOTA: Nel caso di pazienti che richiedono la conservazione della fertilità per motivi oncologici, assicurarsi che non vi sia alcuna lista d’attesa per la pianificazione della consultazione e che l’appuntamento sia fornito il prima possibile. Esaminare la storia medica e la documentazione precedente e valutare lo stato di salute generale del paziente. Registrare tutte le informazioni (compresa l’approvazione dell’oncologo a sottoporsi a stimo…

Representative Results

Panoramica del programma di conservazione della fertilità al centro In un periodo di 12 anni (2008-2020), 285 donne sono state sottoposte ad almeno un prelievo di ovociti che ha comportato la vitrificazione dell’intera coorte di ovuli maturi raccolti. La maggior parte di queste donne (n = 250) ha subito un singolo recupero e 35 hanno subito più recuperi. Le ragioni per sottoporsi al prelievo di ovociti per la vitrificazione degli ovuli sono riassunte in 4 categorie: medico (…

Discussion

Considerazioni cliniche

Sebbene siano state esplorate strategie emergenti, come la crioconservazione del tessuto ovarico e la maturazione in vitro, la vitrificazione degli ovociti dopo COS è la tecnica gold standard per la conservazione della fertilità. In questo scenario, il numero di ovociti recuperati e crioconservati dovrebbe essere massimizzato nel più breve tempo possibile poiché la maggior parte dei pazienti oncologici potrebbe beneficiare esclusivamente di un cicl…

Materials

Collection
Equipment
Hot plate	IVF TECH
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Vacuum Pump	Cook	K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)	Cook	K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish	Corning	353803	Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes	Falcon	352001	Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes	Falcon	352003	Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator	Eppendorf	Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin	thermoFisher Scietific	9988
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101	80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish	Falcon	353653	Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA	1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-6	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )	Cook	K-FPIP-1130-10BS-7	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin	Fujifilm Irvine Scientific	9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-so	2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit	Coopersurgical Origio	42782001A	VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
SAtripping pipette tips (300µm)	Cook	K-FPIP-1300-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-so	4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)