La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali. Adeguate strategie cliniche e di laboratorio garantiscono la massima efficacia, efficienza e sicurezza dei trattamenti di conservazione della fertilità.
Preservare la fertilità femminile è fondamentale in un sistema sanitario multifunzionale che si prende cura della futura qualità della vita dei pazienti. La crioconservazione degli ovociti è riconosciuta da diverse società scientifiche internazionali come il gold standard per la conservazione della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche. Le principali indicazioni mediche sono le malattie oncologiche, le malattie ginecologiche come l’endometriosi grave, le malattie sistemiche che compromettono la riserva ovarica e le condizioni genetiche che comportano la menopausa precoce. Questo documento descrive l’intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull’evidenza. Inoltre, si concentra sull’efficacia della procedura e descrive le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di prelievo degli ovociti, denudazione e vitrificazione sono state dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l’efficacia, l’efficienza e la sicurezza.
Lo sviluppo e l’implementazione di un efficiente programma di crioconservazione per gli ovociti umani è stato un passo avanti significativo nella medicina riproduttiva. Secondo recenti evidenze, la vitrificazione è la strategia più efficace per crioconservare gli ovociti della metafase II (MII), in quanto si traduce in tassi di sopravvivenza statisticamente più elevati rispetto al congelamento lento, indipendentemente dalla popolazione di pazienti (pazienti infertili o programma di donazione di ovociti)1,2,3. I notevoli risultati della vitrificazione degli ovociti hanno portato i comitati di pratica dell’American Society for Reproductive Medicine (ASRM) e della Society for Assisted Reproductive Technology (SART) a dichiarare questa tecnica come la più efficace per la conservazione elettiva della fertilità nelle donne postpuberali, sia per indicazioni mediche che non mediche4,5,6. Le indicazioni mediche per la conservazione della fertilità includono (i) il cancro e le malattie autoimmuni che richiedono terapie7 come la radioterapia, la chemioterapia citotossica e la terapia endocrina (il cui effetto dannoso sulla riserva ovarica è associato all’età materna, nonché al tipo e alla dose del trattamento); (ii) malattie ovariche che richiedono un intervento chirurgico ripetuto o radicale (come l’endometriosi)8; e (iii) condizioni genetiche (ad esempio, X-fragile) o insufficienza ovarica prematura. Inoltre, la conservazione della fertilità è diventata un’opzione preziosa per tutte le donne che non hanno raggiunto il loro obiettivo genitoriale per motivi non medici (noto anche come congelamento sociale).
Indipendentemente dall’indicazione per la conservazione della fertilità e secondo le principali linee guida internazionali sulla conservazione della fertilità, tutti i pazienti disposti a vetrificare i loro ovociti dovrebbero ricevere una consulenza appropriata per essere informati sulle loro realistiche possibilità di successo, i costi, i rischi e le limitazioni della procedura9,10,11,12,13. Ancora più importante, dovrebbe essere chiaro che la vitrificazione di una coorte di ovociti MII non garantisce una gravidanza, ma che offre una maggiore possibilità di successo per il futuro trattamento di fecondazione in vitro (FIV), se necessario14. A questo proposito, l’età della donna al momento della vitrificazione degli ovociti è sicuramente il fattore limitante15 più importante in quanto l’età materna avanzata (AMA; >35 anni) è la causa principale dell’infertilità femminile16. Oltre a una progressiva riduzione della riserva ovarica, l’AMA è associata a una compromissione della competenza degli ovociti a causa di percorsi fisiologici difettosi come il metabolismo, la regolazione epigenetica, i checkpoint del ciclo cellulare e la segregazione meiotica17. Pertanto, il numero ragionevole di uova da vetrificare dipende principalmente dall’età materna. Nelle donne di età inferiore ai 36 anni, sono necessari almeno 8-10 ovociti MII18 per massimizzare le possibilità di successo. In generale, maggiore è il numero di ovociti vitrificati, maggiore è la probabilità di successo. Pertanto, adattare la stimolazione ovarica in base ai marcatori della riserva ovarica come i livelli di ormone anti-Mülleriano (AMH) o la conta dei follicoli antrali (AFC) è fondamentale per sfruttare appieno la riserva ovarica nel più breve tempo possibile.
La sicurezza dell’intera procedura è l’altra questione chiave quando si arruolano pazienti per la conservazione della fertilità. I medici dovrebbero impiegare le migliori strategie per ridurre al minimo i rischi e prevenire la sindrome da iperstimolazione (i) ovarica (OHSS) utilizzando approcci sicuri come il protocollo antagonista dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) seguito da un trigger agonista GnRH19 e (ii) i rischi remoti, ma possibili, di sanguinamento peritoneale, lesioni alle strutture pelviche (uretere, intestino, appendice, nervi) o infezione pelvica durante il recupero degli ovociti. Infine, (iii) i regimi tradizionali per la stimolazione sono associati all’estradiolo sierico soprafisiologico e, pertanto, non sono raccomandati nelle malattie sensibili agli estrogeni come il cancro al seno. I protocolli che coinvolgono inibitori dell’aromatasi (come letrozolo o tamoxifene) sono più adatti in questi casi20,21. In laboratorio, il protocollo più diffuso per la vitrificazione degli ovociti è ancora quello descritto per la prima volta da Kuwayama e colleghi2,23,che consiste in una procedura graduale che prevede l’aggiunta graduale di crioprotezioni (CPA). Nella prima fase (equilibrio/disidratazione), gli ovociti sono esposti in una soluzione di CPA contenente il 7,5% v/v di glicole etilenico e il 7,5% v/v dimetilsolfossido (DMSO), mentre nella seconda fase gli ovociti vengono spostati in una soluzione di vetrificazione con 15% v/v etilenglicole e 15% v/v DMSO, più 0,5 mol/L saccarosio. Dopo una breve incubazione nel mezzo della vitrificazione, gli ovociti possono essere collocati in criodevice aperte appositamente progettate e infine immersi in azoto liquido a -196 °C per essere conservati fino all’uso.
Qui, l’intero work-up clinico e di laboratorio di un trattamento di conservazione della fertilità è stato descritto (i) delineando raccomandazioni per una consulenza obiettiva e basata sull’evidenza, (ii) concentrandosi sul rapporto costo-efficacia della procedura e (iii) descrivendo le strategie più appropriate per sfruttare appieno la riserva ovarica e massimizzare il numero di ovociti recuperati nel più breve tempo possibile. La valutazione della riserva ovarica, la definizione di un protocollo di stimolazione ideale, nonché le procedure di recupero degli ovociti, denudazione e vitrificazione saranno dettagliate insieme agli approcci per massimizzarne l’efficacia, l’efficienza e la sicurezza. Poiché esistono altri protocolli o adattamenti di questo protocollo in letteratura, i risultati rappresentativi e le sezioni di discussione di questo manoscritto si applicano solo a questa procedura.
Considerazioni cliniche
Sebbene siano state esplorate strategie emergenti, come la crioconservazione del tessuto ovarico e la maturazione in vitro, la vitrificazione degli ovociti dopo COS è la tecnica gold standard per la conservazione della fertilità. In questo scenario, il numero di ovociti recuperati e crioconservati dovrebbe essere massimizzato nel più breve tempo possibile poiché la maggior parte dei pazienti oncologici potrebbe beneficiare esclusivamente di un cicl…
The authors have nothing to disclose.
Nessuno
Collection | |||
Equipment | |||
Hot plate | IVF TECH | ||
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Thermometer | |||
Test tube Warmer | |||
Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
Vacuum Pump | Cook | K-MAR-5200 | |
Consumables | |||
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Ovum Aspiration Needle (Single lumen) | Cook | K-OSN-1730-B-60 | |
Primaria Dish | Corning | 353803 | Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish |
Round- bottom tubes | Falcon | 352001 | Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap |
Round- bottom tubes | Falcon | 352003 | Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE |
Denudation | |||
Equipment | |||
CO2 incubator | Eppendorf | Galaxy 14S | |
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl |
Human Serum Albumin | thermoFisher Scietific | 9988 | |
Hyaluronidase | Fujifilm Irvine Scientific | 90101 | 80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF |
IVF culture dish (60 x 15mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF One well dish | Falcon | 353653 | Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
Rubber Bulb | Sigma Aldrich | Z111589-12EA | 1 mL for pasteur pipettes |
Sterile glass Pasteur pipettes | Hunter Scientific | PPB150-100PL | Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE |
stripping pipette tips (140 µm) | Cook | K-FPIP-1140-10BS-6 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (130 µm ) | Cook | K-FPIP-1130-10BS-7 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
Human Serum Albumin | Fujifilm Irvine Scientific | 9988 | |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Modified HTF Medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90126 | HEPES-Buffered medium |
stripping pipette tips (170 µm) | Cook | K-FPIP-1170-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Freeze kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90133-so | 2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL) |
Vitrifit | Coopersurgical Origio | 42782001A | VitriFit Box |
Warming | |||
Equipment | |||
Electronic Timer | |||
Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
Gilson Pipetman | Gilson | F123601 | p200 |
k-System Incubator | Coopersurgical | G210Invicell | |
Lab Markers | Sigma Aldrich | ||
Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
Stainless Container for Cooling Rack | Kitazato | Liquid nitrogen container for vitrification | |
Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
Consumables | |||
Biopur epTIPS Rack | Eppendorf | 30075331 | Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL |
CSCM (Continuos single culture complete) medium | Fujifilm Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
IVF culture dish (60 x 15 mm) | Corning | 353802 | Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish |
IVF dish 4-well plate with sliding lid | ThermoFisher Scietific | 176740 | Multidishes 4 wells (Nunc) |
IVF dish 6-well | Oosafe | OOPW-SW02 | OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER |
Mineral Oil for embryo culture | Fujifilm Irvine Scientific | 9305 | |
SAtripping pipette tips (300µm) | Cook | K-FPIP-1300-10BS-5 | PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING |
Vitrification Thaw kit | Fujifilm Irvine Scientific | 90137-so | 4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL) |