Préservation de la fertilité par vitrification des ovocytes : perspectives cliniques et de laboratoire

Summary

La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la norme d’or pour la préservation de la fertilité chez les femmes postpubères. Des stratégies cliniques et de laboratoire appropriées garantissent une efficacité, une efficience et une sécurité maximales des traitements de préservation de la fertilité.

Abstract

La préservation de la fertilité féminine est cruciale dans un système de santé multifonctionnel qui prend soin de la qualité de vie future des patients. La cryoconservation des ovocytes est reconnue par plusieurs sociétés scientifiques internationales comme la référence en matière de préservation de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour des indications médicales que non médicales. Les principales indications médicales sont les maladies oncologiques, les maladies gynécologiques telles que l’endométriose sévère, les maladies systémiques compromettant la réserve ovarienne et les conditions génétiques impliquant une ménopause prématurée. Cet article décrit l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité en décrivant des recommandations pour des conseils objectifs et fondés sur des preuves. En outre, il se concentre sur l’efficacité de la procédure et décrit les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification ont été détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité.

Introduction

Le développement et la mise en œuvre d’un programme efficace de cryoconservation des ovocytes humains ont été une percée importante en médecine de la reproduction. Selon des preuves récentes, la vitrification est la stratégie la plus efficace pour cryoconserver les ovocytes de la métaphase II (MII), car elle entraîne des taux de survie statistiquement plus élevés par rapport à la congélation lente, indépendamment de la population de patients (patients infertiles ou programme de don d’ovocytes)^1,2,3. Les réalisations remarquables de la vitrification ovocytaire ont conduit les comités de pratique de l’American Society for Reproductive Medicine (ASRM) et de la Society for Assisted Reproductive Technology (SART) à déclarer que cette technique était la plus efficace pour la préservation élective de la fertilité chez les femmes postpubères, tant pour les indications médicales que non médicales^4,5,6. Les indications médicales pour la préservation de la fertilité comprennent (i) le cancer et les maladies auto-immunes qui nécessitent des thérapies⁷ telles que la radiothérapie, la chimiothérapie cytotoxique et la thérapie endocrinienne (dont l’effet néfaste sur la réserve ovarienne est associé à l’âge maternel ainsi qu’au type et à la dose du traitement); ii) les maladies de l’ovaire nécessitant une chirurgie répétée ou radicale (comme l’endométriose)⁸; et (iii) des affections génétiques (p. ex., X-fragile) ou une insuffisance ovarienne prématurée. En outre, la préservation de la fertilité est devenue une option précieuse pour toutes les femmes qui n’ont pas atteint leur objectif parental pour des raisons non médicales (également connu sous le nom de gel social).

Quelle que soit l’indication pour la préservation de la fertilité et conformément aux principales directives internationales sur la préservation de la fertilité, tous les patients désireux de vitrifier leurs ovocytes doivent recevoir des conseils appropriés pour être informés de leurs chances réalistes de succès, des coûts, des risques et des limites de la procédure^{9,10 , 11,12,13}. Plus important encore, il devrait être clair que la vitrification d’une cohorte d’ovocytes MII n’assure pas une grossesse, mais qu’elle offre une plus grande chance de succès pour le futur traitement de fécondation in vitro (FIV), si nécessaire¹⁴. À cet égard, l’âge de la femme au moment de la vitrification ovocytaire est certainement le facteur limitant le plus important¹⁵ car l’âge maternel avancé (AMA; >35 ans) est la principale cause d’infertilité féminine¹⁶. Outre une réduction progressive de la réserve ovarienne, l’AMA est associée à une altération de la compétence ovocytaire due à des voies physiologiques défectueuses telles que le métabolisme, la régulation épigénétique, les points de contrôle du cycle cellulaire et la ségrégation méiotique¹⁷. Par conséquent, le nombre raisonnable d’ovules à vitrifier dépend principalement de l’âge de la mère. Chez les femmes de moins de 36 ans, au moins 8 à 10 ovocytes MII¹⁸ sont nécessaires pour maximiser les chances de succès. En général, plus le nombre d’ovocytes vitrifiés est élevé, plus la probabilité de succès est élevée. Par conséquent, l’adaptation de la stimulation ovarienne en fonction de marqueurs de réserve ovarienne tels que les niveaux d’hormone anti-müllérienne (AMH) ou le nombre de follicules antraux (AFC) est cruciale pour exploiter pleinement la réserve ovarienne dans les plus brefs délais.

La sécurité de l’ensemble de la procédure est l’autre question clé lors de l’inscription de patients pour la préservation de la fertilité. Les cliniciens devraient employer les meilleures stratégies pour minimiser les risques et prévenir (i) le syndrome d’hyperstimulation ovarienne (SHO) en utilisant des approches sûres telles que le protocole d’antagoniste de l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) suivi d’un déclencheur agoniste de la GnRH¹⁹ et (ii) les risques éloignés, mais possibles, de saignement péritonéal, de lésion des structures pelviennes (uretère, intestin, appendice, nerfs) ou d’infection pelvienne lors du prélèvement d’ovocytes. Enfin, (iii) les schémas thérapeutiques traditionnels de stimulation sont associés à l’œstradiol sérique supraphysiologique et ne sont donc pas recommandés dans les maladies sensibles aux œstrogènes telles que le cancer du sein. Les protocoles impliquant des inhibiteurs de l’aromatase (tels que le létrozole ou le tamoxifène) sont plus appropriés dans ces cas^20,21. En laboratoire, le protocole le plus répandu pour la vitrification ovocytaire est encore celui décrit pour la première fois par Kuwayama et ses collègues^2,23, qui consiste en une procédure par étapes impliquant l’ajout progressif de cryoprotecteurs (CPA). Dans la première phase (équilibre/déshydratation), les ovocytes sont exposés dans une solution de CPA contenant 7,5 % v/v d’éthylène glycol et 7,5 % v/v de diméthylsulfoxyde (DMSO), tandis que dans la deuxième phase, les ovocytes sont déplacés vers une solution de vitrification avec 15 % v/v d’éthylène glycol et 15 % v/v de DMSO, plus 0,5 mol/L de saccharose. Après une courte incubation dans le milieu de la vitrification, les ovocytes peuvent être placés dans des cryodispositifs ouverts spécialement conçus et finalement plongés dans de l’azote liquide à -196 °C pour être conservés jusqu’à utilisation.

Ici, l’ensemble du bilan clinique et de laboratoire d’un traitement de préservation de la fertilité a été décrit en (i) décrivant des recommandations pour un conseil objectif et fondé sur des preuves, (ii) en se concentrant sur le rapport coût-efficacité de la procédure et (iii) en décrivant les stratégies les plus appropriées pour exploiter pleinement la réserve ovarienne et maximiser le nombre d’ovocytes prélevés dans les plus brefs délais. L’évaluation de la réserve ovarienne, la définition d’un protocole de stimulation idéal, ainsi que les procédures de prélèvement d’ovocytes, de dénudation et de vitrification seront détaillées ainsi que des approches visant à maximiser leur efficacité, leur efficience et leur innocuité. Comme d’autres protocoles ou adaptations de ce protocole existent dans la littérature, les résultats représentatifs et les sections de discussion de ce manuscrit ne s’appliquent qu’à cette procédure.

Protocol

1. Travail et counseling clinique REMARQUE: Dans le cas de patients nécessitant une préservation de la fertilité pour des raisons oncologiques, assurez-vous qu’il n’y a pas de liste d’attente pour planifier la consultation et que le rendez-vous est fourni dès que possible. Examinez les antécédents médicaux et la documentation antérieure et évaluez l’état de santé général du patient. Enregistrer toutes les informations (y compris l’approbation de l’o…

Representative Results

Aperçu du programme de préservation de la fertilité au centre Sur une période de 12 ans (2008-2020), 285 femmes ont subi au moins un prélèvement d’ovocytes impliquant la vitrification de toute la cohorte d’ovules matures collectés. La plupart de ces femmes (n = 250) ont subi une seule récupération, et 35 ont subi plusieurs récupérations. Les raisons de subir un prélèvement d’ovocytes pour la vitrification des ovules sont résumées en 4 catégories: médical…

Discussion

Considérations cliniques

Bien que des stratégies émergentes, telles que la cryoconservation du tissu ovarien et la maturation in vitro, aient été explorées, la vitrification des ovocytes après COS est la technique de référence pour la préservation de la fertilité. Dans ce scénario, le nombre d’ovocytes prélevés et cryoconservés devrait être maximisé dans les plus brefs délais, car la plupart des patientes atteintes de cancer pourraient bénéficier uniquem…

Materials

Collection
Equipment
Hot plate	IVF TECH
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermometer
Test tube Warmer
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Vacuum Pump	Cook	K-MAR-5200
Consumables
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Ovum Aspiration Needle (Single lumen)	Cook	K-OSN-1730-B-60
Primaria Dish	Corning	353803	Corning Primaria Dish 100×20 mm style standard cell culture dish
Round- bottom tubes	Falcon	352001	Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Test tube with snap cap
Round- bottom tubes	Falcon	352003	Oocyte collection tubes/ Falcon 5ml 12×75 Round Bottom Polipropilene Test tube with snap cap
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubator	Eppendorf	Galaxy 14S
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µl
Human Serum Albumin	thermoFisher Scietific	9988
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101	80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF
IVF culture dish (60 x 15mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF One well dish	Falcon	353653	Falcon 60 x 15 mm TC treated center-well IVF
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
Rubber Bulb	Sigma Aldrich	Z111589-12EA	1 mL for pasteur pipettes
Sterile glass Pasteur pipettes	Hunter Scientific	PPB150-100PL	Pipette Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
stripping pipette  tips (140 µm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-6	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (130 µm )	Cook	K-FPIP-1130-10BS-7	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
Human Serum Albumin	Fujifilm Irvine Scientific	9988
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Modified HTF Medium	Fujifilm Irvine Scientific	90126	HEPES-Buffered medium
stripping pipette tips (170 µm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Freeze kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-so	2 Vials of ES (Equilibration Solution, 2 x 1 mL) and 2 Vials of VS (Vitrification Solution, 2 x 1 mL)
Vitrifit	Coopersurgical Origio	42782001A	VitriFit  Box
Warming
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper  holder
Gilson Pipetman	Gilson	F123601	p200
k-System Incubator	Coopersurgical	G210Invicell
Lab Markers	Sigma Aldrich
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Stainless Container for Cooling Rack	Kitazato		Liquid nitrogen container for vitrification
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Consumables
Biopur epTIPS Rack	Eppendorf	30075331	Micropipettes epTIPS Biopur 2-200 µL
CSCM (Continuos single culture complete) medium	Fujifilm Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
IVF culture dish (60 x 15 mm)	Corning	353802	Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria standard cell culture dish
IVF dish 4-well plate with sliding lid	ThermoFisher Scietific	176740	Multidishes 4 wells (Nunc)
IVF dish 6-well	Oosafe	OOPW-SW02	OOSAFE® 6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER
Mineral Oil for embryo culture	Fujifilm Irvine Scientific	9305
SAtripping pipette tips (300µm)	Cook	K-FPIP-1300-10BS-5	PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-so	4 Vials of TS (Thawing Solution, 4 x 2 mL) + 1 Vial of DS (Dilution Solution, 1 x 2 mL) +1 Vial of WS (Washing Solution, 1 x 2 mL)