CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

Summary

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

Abstract

세균클러스터는 정기적으로 간격이 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/연쇄상 구균 pyogenes CRISPR 관련 단백질 (Cas) 시스템은 중요한 생물학적으로 관련있는 문제를 연구하기 위하여 연구원에 의해 이용되었습니다. CRISPR/Cas 게놈 편집 방법의 비교할 수 없는 힘은 연구원이 선택한 궤적을 정확하게 편집하여 유전자 기능에 대한 이해를 높일 수 있게 합니다. CRISPR/Cas9에 의하여 C. elegans 게놈을 편집하기 위한 몇몇 방법은 이전에 기술되었습니다. 여기서, 우리는 시험관 내 리보뉴클레오단백질 복합체및 단피-10 공동 CRISPR 마커를 선별에 활용하는 방법을 논의하고 시연한다. 특히,이 문서에서는 CRISPR /Cas9 편집 방법을 사용하여 homology 지향 수리에 의해 C. elegans rbm-3.2 유전자에 조기 정지 코도를 도입하는 단계별 과정을 거닐습니다. 이 비교적 간단한 편집 방법은 관심있는 유전자의 기능을 연구하는 데 사용할 수 있으며 CRISPR / Cas9 편집에 의해 2 주 이내에 균질하게 편집 된 C. elegans의 생성을 허용합니다.

Introduction

클러스터된 정규 간 짧은 Palindromic 반복(CRISPR)/ 연쇄상 구균 pyogenes CRISPR 관련 단백질(Cas) 기술은 광범위한 유기체^{1,2,3,4에서}효율적인 표적 게놈 편집을 가능하게 한다. CRISPR 시스템은 원핵항바이러스 면역반응^5,6,7의일부로 처음 발견되었다. 타입 II CRISPR 시스템은 Cas9, 환전 RNA (tracrRNA) 및 짧은 표적 DNA 특이적 20-뉴클레오티드 롱 가이드 CRISPR RNA (crRNA)와 같은 엔도넬리스를 사용하여 “NGG” 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 인식하고 표적DNA^{5,6,7,8,1, 1, 1, 1, 1, 12, 12, 12, 12, 12, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 10,10대에서}이중 좌초된 브레이크를 만듭니다. 이 이중 좌초 휴식은 세포 DNA 수리 기계에 의해 병변으로 인식된다. 따라서, 생성된 이중 좌초 브레이크는 두 개의 통로 중 하나에 의해 수리될 수 있다-i) 비동상화 종조(NHEJ) 또는 ii) 모모로지 지향 수리(HDR)^13. NHEJ는 종종 오류가 발생하기 쉬우므로 이 경로가 표적 DNA에서 이중 좌초 된 휴식을 복구하는 데 사용될 때 관심 유전자에서 돌연변이 (삽입, 삭제)를 유발합니다. 한편, 이중 가닥 파손의 양쪽에 상동성을 가진 외인성 수리 템플릿을 공급함으로써, 셀룰러 DNA 수리 기계는^{브레이크(13)를}복구하기 위해 HDR을 사용하도록 지시할 수 있다. 따라서 HDR 방법을 사용하면 관심 있는 궤적을 정밀하게 편집할 수 있습니다.

다양한 CRISPR/Cas9 유전자 편집 프로토콜은 C. elegans^{14,15,16,17,18,19,20을}위해기술되었다. C. elegans에서 가장 일반적으로 사용되는 CRISPR/Cas9 편집 방법에는 CRISPR/Cas9 편집^{14,15,16,17,18,19,20을}위한 수리 템플릿을 생성하는 복제 기반 및 복제 없는 프로토콜이 모두 포함됩니다. 이 프로토콜은 dpy-10을 스크리닝을 위한 공동 CRISPR 마커로 사용하는 기반으로 복제가 없는 CRISPR/Cas9 편집 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 지금까지, 유일하게 상세한 C. elegans-초점CRISPR/Cas9 편집 비디오 프로토콜 존재 하는 존재 는²¹을 선별하기 위한 형광 마커를 활용 하 고 있습니다. 그러나, 검열을 위한 형광 마커를 사용하여 형광 현미경에 접근이 필요합니다, 작은 1 차 학부 기관 (PUI)에 있는 많은 실험실은 접근하기 어려울 수 있습니다. 형광 마커를 운반하는 벌레와 편집^21,22의존재 사이의 이전 연구에서 긍정적 인 상관 관계 결과가 얻어졌다는 점에 유의하는 것이 고무적이다. 그러나, 다른 가이드 RNA 및 수리 템플릿으로 다양한 로시를 편집하기 위한 형광 기반 스크리닝 방법의 전반적인 효율을 결정하기 위한 추가 연구가 필요하다. 마지막으로, 이러한 형광 마커에 대한 플라스미드 인코딩은 초염색체 어레이를 형성하기 때문에, 가변 형광은 종종^23을식별하기 어렵게 만들 수 있는 이러한 어레이로부터 생성된다. 따라서 형광 기반 스크리닝 방법은 채택하는 데 유용할 수 있지만, 위에서 언급한 문제는 그 적용가능성을 제한할 수 있다.

눈에 보이는 표현형을 생성하는 공동 CRISPR 마커를 사용하면 양성 편집된^{웜(23,24,25, 25,26,27,28)을}찾기 위해 스내젠의 수를 크게 감소시킨다. 중요한 것은, 이러한 마커에 의해 생성되는 표현형은 간단한 해부^{현미경(23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34)}하에서 쉽게 검출될 수 있다. dpy-10 공동 CRISPR 마커는 C. elegans CRISPR/Cas9 게놈 편집^24,27을수행하기 위한 최고의 특징과 널리 사용되는 공동 CRISPR 마커 중하나입니다. 따라서, 본 기사는 공동 CRISPR^{마커(27,35)로} dpy-10을 가진 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달을 이용하여 C. 엘레간에서 CRISPR/Cas9 편집을 수행하는 방법에 대해 논의할 것이다. 이 방법에서, 준비된 편집 사출 믹스는 잘 특징인 dpy-10 crRNA 및 dpy-10 수리 템플릿으로 구성되어 관찰 가능한 지배적인 “롤러”(Rol) 표현형의 생성을 중재하여 dpy-10 유전자^{24,27, 27}내의 알려진 이테로지구우스 dpy-10(cn64) 돌연변이에 의해 수여된다. 그것의 동종구 상태에 존재하는 때, dpy-10 (cn64) 돌연변이는 더 짧고 stouter 벌레^24,29를생성하는 덤프 (Dpy) 표현형을 일으키는 원인이 된다. Rol 표현형은 HDR 매개 CRISPR/Cas9 편집에 의해 dpy-10 유전자의 단일 복사본으로 공동 공급된 dpy-10 복구 템플릿의 정확한 삽입에 의해 매개된다. 따라서 Rol C. elegans의 출현은 주입된 웜 의 세포 내에서 성공적인 HDR 중재 편집 이벤트뿐만 아니라 성공적인 주입을 나타냅니다. 관심 있는 표적 유전자의 crRNA 및 수리 템플릿은 dpy-10 crRNA 및 dpy-10 수리 템플릿과 동일한 사출 혼합물에 있기 때문에, 확인된 Rol 웜도 동시에 관심 있는 표적 유전자에서 편집될 가능성이 높습니다. 따라서, 이러한 Rol 웜은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) (50bp 이상 편집용) 또는 PCR에 의해 관심있는 편집을 위해 스크리니츠를 검사한 다음 제한 소화(50bp 미만의 편집)가 뒤따릅니다.

게놈 편집을 위해 이 방법을 사용하는 장점은: i) CRISPR 편집은 이^방법을사용하여 비교적 높은 효율(2%에서 70%)으로 생성될 수 있다. ii) 이 방법에 사용되는 수리 템플릿 및 가이드 RNA는 복제를 포함하지 않아 생성에 필요한 시간을 줄입니다. iii) 시험관내에서리보뉴클레오단백질 복합체를 조립함으로써, 조립된 편집 복합체의 농도는 비교적 일정하게 유지되어 재현성을 향상시킬 수 있다. iv) 플라스미드에서 발현될 때 편집을 생성하지 못하는 일부 가이드 RNA는 체외 전사 crRNAs^27과같이 공급될 때 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위해 작동하는 것으로 나타났습니다. v) dpy-10 공동 CRISPR 마커를 포함하여 해부 현미경을 사용하여 쉽게 스크리닝할 수 있고 양성^24,27을찾기 위해 스크리닝해야 하는 자손의 수를 감소시면 된다. 및 vi) DNA 염기서열 분석 검증 된 homozygous-편집 웜 라인은 2 주^19,27이내에이 방법에 의해 얻을 수 있다.

많은 다른 C. elegans CRISPR 방법에 관한 우수한 책 장은^{14,15,16,17,18,19,20,43에}게시되었습니다. 그러나, 실험실 설정에서 비디오 형식으로 dpy-10 공동 CRISPR 방법의 데모는 현재 부족. 본 기사에서는, dpy-10 공동 CRISPR 방법을 사용하여 rbm-3.2라는 대표적인 표적 유전자, putative RNA 결합 단백질(WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)을 편집하는 과정을 설명하고 시연한다.  구체적으로, 여기서 우리는 체외 조립 리보뉴클레오단백질 복합체 및 외인성 공급선형 단일 가닥 수리 템플릿을 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자 내에 3개의 조기 정지 코돈을 도입하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 연구 결과는 rbm-3.2 유전자에 있는 조기 정지 코돈과 첫번째 C. elegans CRISPR 긴장을 생성에 성공했습니다. 현재 C. elegans에서 이 유전자의 기능에 관하여 많이 알려지지 않기 때문에, 이 긴장은 RMB-3.2의 기능을 해부에 있는 유용한 공구로 봉사할 것입니다. 이 방법은 또한 C. elegans 게놈 내의 모든 메뚜기에서 삽입, 대체 및 삭제를 만들기 위하여 채택될 수 있습니다.

Protocol

CRISPR/Cas9 게놈 편집을 위한 이 프로토콜은 NIH 지침에 따라 털사 기관 생물안전위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜 을 통해 멸균 기술이 실행되었습니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 뉴클레아제가 없는 시약을 사용하여 수행되었다. RNase 오염 제거 용액을 사용하여 청소 장갑뿐만 아니라 작업 공간 및 장비 (예 : 파이펫, 유리 제품 외관 등)와 같은 RNase 오염을 방지하기 위해 특별한주의를 기울였습니다. 1. crRNA 디자인 Cas9가 편집 사이트에 가장 가깝게 절단할 수 있는 PAM을 찾습니다. PAM 사이트는 5′-NGG-3’입니다. PAM은 DNA의 어느 가닥에있을 수 있음을 기억하십시오. PAM의 5’끝에서 crRNA 서열로 20bp를 선택합니다.참고: 상업회사가 합성하는 실제 crRNA 서열은 합성 회사에 의해 대상별 20bp crRNA 서열에 자동으로 첨가되는 추가 제네릭 서열을 가지기 때문에 20bp 이상이다. 오프 타겟효과와 관련하여, 최근 연구는 C. elegans36,37,38,39,40에서Cas9의 오프 타겟 효과를 발견하지못했습니다. 또한, 그 결과 CRISPR 편집균이 교차됩니다. 따라서, 우리는 설계 된 crRNA의 오프 타겟 효과에 대해 크게 걱정하지 않습니다. 그러나, http://genome.sfu.ca/crispr/ 및 http://crispor.tefor.net/ 포함한 온라인 웹 사이트는 최소한의 오프 타겟효과38,41로crRNA를 찾아 선택하는 데 사용할 수 있습니다. G 또는 GG로 끝나는 crRNA와 50% 이상의 GC 콘텐츠가 있는 사람들은19,23,42보다효율적일 것으로 예상됩니다. 회사에서 crRNA의 최소 10nmol주문(예: IDT, 호라이즌 디스커버리 등). lyophilized crRNA가 도착하면 미세 주입의 날까지 -30 °C에 저장하십시오. 미세 주입을 수행하는 날에는 1 분 동안 최대 속도 (17,000 x g)로 lyophilized crRNA를 회전시키고 5 mM Tris-Cl (pH 7.4)에서 다시 중단하여 crRNA의 8 μg /μL 스톡을 만듭니다. -80°C에서 냉동된 사용하지 않은 crRNA 스톡을 보관합니다. 2. 수리 템플릿 디자인 시퀀스 조작 소프트웨어(예: CLC 서열 뷰어, APE, 스냅진, 벡터 NTI 등)를 다운로드합니다. 우리는 CLC 시퀀스 뷰어 버전 8.0 (Qiagen)을 사용하셔서 사용자 친화적이며 무료로 다운로드 할 수 있습니다. 관심있는 표적 DNA의 시퀀스를 시퀀스 뷰어에 붙여 넣습니다. 복구 템플릿의 방향은 편집효율(28)에영향을 줍니다. PAM의 5′ 끝에 수리 서열을 삽입하려면 PAM 서열(protospacer strand)28이있는 동일한 DNA 가닥에서 DNA 서열을 사용하여 단일 가닥 수리 템플릿을 설계한다. PAM의 3’끝에 수리 서열을 삽입하는 동안 PAM 서열(spacer strand)28을수행하지 않는 DNA 가닥으로부터 DNA 서열을 사용하여 단일 가닥 복구 템플릿을 설계한다. 편집의 양쪽(5’와 3’끝)에서 중단없는 상동성을 가진 35개의 기본 시퀀스를 선택합니다. Cas9에 의해 수리 템플릿 또는 편집 된 게놈 DNA의 절단을 방지하기 위해 PAM을 돌연변이 또는 삭제합니다. PAM의 돌연변이가 불가능한 경우, 수리 템플릿 또는 편집 된 게놈 DNA의 절단을 방지하기 위해 PAM의 5 ‘끝에 가까운 몇 가지 침묵 돌연변이를 소개합니다. 엑소닉 부위에 존재하는 경우에만 PAM의 자동 돌연변이를 도입해야 합니다. 코돈 사용 빈도를 확인하여 돌연변이 된 코돈이 원래 의 비 돌연변이 코돈과 유사한 주파수 (예 : https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table)와 유사한 주파수로 도입되었는지 확인합니다. 어떤 경우에는 돌연변이되지 않은 코돈과 유사한 주파수로 변질된 코동을 도입하지 못할 수도 있습니다. 그러나, 몇몇 아미노산의 돌연변이를 만들기 위한, 우리는 돌연변이 단백질의 발현 수준이 현저하게 변경될 것으로 기대하지 않습니다. 편집이 작으면 (예를 들어 몇 가지 기지의 돌연변이) 침묵하는 돌연변이에 의한 편집에 가까운 독특한 제한 부위를 소개한다. 우리는 침묵 돌연변이 발생에 의해 소개 될 수있는 제한 사이트를 찾기 위해 http://heimanlab.com/cut2.html 사용합니다. 코돈 사용 빈도를 확인하여 변이코돈이 원래 비돌연변이 코돈과 유사한 주파수로 도입되었는지 확인합니다. 위에서 언급했듯이, 이것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 그러나, 몇몇 아미노산의 돌연변이를 관련시키는 실험에 대 한, 우리는 돌연변이 단백질의 발현 수준을 크게 변경 될 것으로 기대 하지 않습니다. 4 nmol 울트라머 올리고로 HDR에 대한 선형 단일 가닥 수리 템플릿을 합성하고 구입합니다. 리오필화된 올리고뉴클레오티드 수리 템플릿을 뉴클레아제없는 물로 재연하여 수리 템플릿의 1 μg/μL 스톡을 만들고 추가 사용이 있을 때까지 -30°C에 보관합니다. 3. 스크리닝 프라이머 디자인 CLC 시퀀스 뷰어 또는 기타 유사한 응용 프로그램을 사용하여 PCR 증폭 시 400~600개의 베이스 쌍의 대역을 생성하도록 편집의 양쪽에 20~23개의 베이스 쌍 앞뒤로 프라이머를 설계합니다. 크기가 여러 킬로베이스인 더 큰 삽입의 경우 수리 템플릿의 왼쪽 상동성 암 바로 바깥에 위치하도록 전방 프라이머를 디자인합니다. 수리 템플릿 자체에 위치하도록 역프라이머를 디자인합니다. 이 경우 PCR 제품은 긍정적으로 편집된 웜의 경우에만 얻을 수 있습니다. 더 긴 삽입을 위해 동종구균으로 편집된 웜을 식별하려면 삽입 접합부 외부에 있는 전방 및 역프라이머를 설계하여 삽입의 전체 영역을 증폭시합니다. 프라이머를 테스트하고 유전자 를 위해 프라이머를 사용하기 전에 야생 형 게놈 DNA로 PCR 조건을 최적화하십시오. 유전체 DNA의 PCR 증폭시 예상 크기의 단일 밴드가 생성되는지 확인하십시오(해당하는 경우). 4. 주입을 위한 젊은 성인 벌레 준비 MyOB 플레이트의 신선한 세균 잔디밭에 L2-L3 스테이지 C. elegans를 선택하고 하룻밤 사이에 20 °C에서 배양하십시오.참고: MYOB 플레이트 를 만들기 위한 프로토콜은 여기에서 찾을 수 있습니다 http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/. 미세 주입의 날에, 주입하는 자궁에 있는 10 개 미만의 태아를 가진 젊은 성인 벌레를 선택합니다. 5. 사출 믹스 준비 멸균 뉴클레아제 없는 튜브에서 표 1에 도시된 것과 동일한 순서로 사출 혼합물을 준비한다.참고: 이 혼합물을 가진 향후 주사가 예상되지 않는 경우 주사 혼합물의 구성 요소를 축소하여 5 μL 사출 믹스(20 μL 대신)를 만들 수 있습니다. 파이펫팅으로 사출 믹스를 섞는다. 리보뉴클레오단백질 복합체를 조립하기 위해 37°C에서 15분간 주입혼합물을 배양한다. 사출 믹스를 17,000 x g에서 5분간 4°C에서 회전시킵니다. 6. C. 예인선 고나드에 미세 주입 Iyer 등에서 설명한 바와 같이, C. elegans gonad에 CRISPR 주입 믹스의 미세 주입을 수행. 201943. CRISPR 주입 믹스로 약 30 개의 웜을 주입하십시오. 사용하지 않은 사출 믹스는효율(49)의손실 없이 약 6개월 동안 4°C에 저장하여 재사용할 수 있다. 가능하면 두 고나드 팔을 모두 주입하십시오. 주입된 웜은 P0 세대로 간주됩니다. 7. 주입 된 웜 복구 및 전송 미세 주입 후, OP50 대장균으로 시드된 60mm MYOB 한천 판을 사용하여 마이크로주입된 P0 웜을 이동하여 실온에서 약 1시간 동안 회수하게 한다. 복구 온도는 주입된 웜의 유전자형에 따라 달라집니다. 예를 들어 온도에 민감한 균주의 경우 다른 온도에서 웜 복구가 필요할 수 있습니다. 플래티넘 와이어 웜 픽을 사용하여, 각 주입된 웜을 단일 시드 35mm MYOB 아가 페트리 플레이트에 옮기고 다음 날까지 20°C에서 알을 낳을 수 있도록한다. 일부 벌레는 미세 주입 절차에서 부상의 결과로 죽을 것이다. 살아있는 벌레만 선택하고 움직임을 전시합니다. 24시간 후 주입된 웜을 새로운 개별 플레이트(플레이트당 1웜)로 이송합니다. 8. C를 따기 . 검사를 위한 엘레그 주사가 수행 된 후 20 °C에서 3 ~ 4 일, 해부 현미경을 사용하여 주입 된 벌레의 자손을 포함하는 모든 플레이트를 모니터링합니다. F1 자손 전시 롤러 (롤) 및 덤프 (Dpy) 표현형이있는 플레이트를 식별합니다. Dpy 표현형은 웜이 동일한 발달 단계에서 벌레를 제어하는 것보다 짧고 계단식으로 보이는 곳입니다(WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0–10). Rol 및 Dpy 웜을 가진 플레이트는 F1 자손이 성공적으로 dpy-10(cn64) 돌연변이로 편집된 플레이트를 나타내며, 각각 이종화구 또는 동질구 상태에 존재하게 된다. 스크리닝을 위해 가장 롤러와 덤프 웜이 있는 플레이트를 선택합니다. 이 플레이트에서 50-100 F1 Rol 웜을 자신의 개별 플레이트(플레이트당 웜 1개)로 선별하여 알을 낳을 수 있도록 합니다. L4 단계F1 롤 웜이 알을 낳고 자손 (F2)을1~ 2 일 동안 생산하도록 허용하십시오. 9. 단일 웜 리시스 및 PCR 1 내지 2 일 동안 F2를 생산 한 후, 각 단일 F1 롤 어머니를 2.5 μL의 용해 버퍼 (표 2)로 전송하여 20 mg / mL Proteinase K의 1:100 희석을 합니다. 20 분 동안 -30 °C에서 튜브를 동결합니다. 웜은 추가 분석될 때까지 장기간 이 단계에서 저장할 수 있습니다. 다음 조건과 PCR 열순환기에서 단일 웜 용액을 수행 : 1 시간 동안 60 °C, 15 분 동안 95 °C및 4 ° C에서 유지. PCR 튜브를 함유한 용액의 2.5 μL에 직접 다음 시약을 추가하십시오: dNTP, DNA 폴리머라제, MgCl2 및 적재염료의 2x PCR 믹스의 12.5 μL, 1μM 전방 프라이머의 1μL, 10μM 역 프라이머의 1μL, 멸균 수 22.5 μL에 직접 추가하십시오. 각 PCR 반응의 총 부피는 25 μL입니다.참고: 여러 F1 웜을 스크리닝하는 경우 여러 반응에 PCR 마스터 믹스를 만들고 각 리시스 튜브에 마스터 믹스의 22.5 μL을 추가하는 것이 더 빠르고 편리합니다. 다음 조건으로 열순환기상에 PCR 반응을 설정: 1분 동안 95°C, 15s용 95°C의 35사이클, 15s(각 프라이머 세트에 최적화), 72°C(각 표적 DNA에 최적화)44. 4°C에서 반응을 유지합니다. 10. 제한 소화 및 아가로즈 젤 전기 포전 참고: 작은 편집(50bp 미만)을 검사하는 동안에만 제한 소화가 필요합니다. PCR DNA의 10 μL을 9단계에서 새로운 튜브로 옮기다. 15 μL 반응 당 2 ~4 단위의 제한 효소 완충제(10x 반응 완충제의 1.5 μL)를 추가합니다. 2시간 동안 37°C(또는 다른 효소 특이 온도)에서 배양(빠른 작용 효소로 더 짧은 인큐베이션 시간이 가능할 수 있음). 열은 PCR 튜브를 65°C(또는 기타 효소 별 온도)에서 10~15분 동안 가열하여 제한 소화를 비활성화합니다. 각 PCR 튜브의 전체 반응을 1%-2% 아가로즈 젤의 단일 웰에 적재하고 적절한 대역 분리가 이루어질 때까지 110mA에서 젤을 실행합니다.참고: 아가로즈 젤에서 실행되는 동안 시각화에 이미 로딩 염료가 포함된 PCR 믹스를 사용합니다. 이 혼합제한 소화 반응을 방해하지 않으므로 한 번에 많은 웜을 선별하는 데 사용하기가 편리합니다. 11. 긍정적으로 편집된 웜 식별 DNA 밴드 크기를 감지하기 위해 UV 빛(에티듐 브로마이드 젤용)에서 아가로즈 젤을 시각화합니다.참고: 긍정적으로 편집된 웜은 웜 게놈 내의 원하는 궤적에서 제한 부위를 운반하는 수리 템플릿을 사용하여 편집하여 예상되는 크기로 추가 DNA 밴드를 표시합니다. F1 롤러 웜은 편집을 위해 이종구우스가 될 것으로 예상되므로 3개의 대역(야생형 절단 PCR 제품 1개 및 편집된 절단 PCR 제품에서 2개의 작은 조각)을 전시할 것으로 예상됩니다. 드물지만, 호모자고테스가 때때로 발생한다는 점에 유의해야합니다. 편집의 존재가 Sanger 순서에 의해 확인 될 때까지 모든 원래의 긍정적으로 편집 된 플레이트를 저장합니다. 12. 호모지고세 편집 각각의 양수 편집 F1 Rol 웜 플레이트에서 8~12개의 야생형 보이는 비압 F2 웜을 선택하고 1~2일 동안 알을 낳고 자손생성을 할 수 있도록 한다.참고: C. elegans가 자가 수정 된 헤르마프로디트이기 때문에 편집 된 알렐이 생존 또는 발달에 영향을 미치지 않으면 예상 된 동질 돌연변이의 비율은 약 25 %여야합니다. 비압 F2 웜은 dpy-10 궤적의 야생 식이어야 합니다. 비 롤링 웜을 따기 dpy-10 (cn64) 돌연변이를 잃고 관심의 유전자에 돌연변이가 편집 된 웜의 생성을 가능하게한다. dpy-10 유전자는 염색체 II에 존재한다는 것을 유의하십시오. 관심의 유전자가 dpy-10에연결되는 경우에, 당신은 쉽게 관심있는 유전자에서 dpy-10 돌연변이를 분리하지 못할 수 있습니다. 11단계를 통해 9단계를 수행하여 동형질 벌레 라인을 식별합니다. 13. 시퀀싱으로 편집 확인 동종구벌레가 식별되면 9단계에서 설명된 대로 리스와 PCR을 수행합니다. 시퀀스가 될 각 동형구선에 대해 적어도 3개의 PCR 반응을 설정한다. PCR 정화 키트를 사용하여 PCR 반응을 정화합니다. 나노드롭 분광광계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. Sanger 시퀀싱에 대한 각 전방 프라이머와 함께 샘플을 보냅니다. 전방 프라이머가 시퀀스가 될 편집에서 최소 50개의 베이스로 설계되었는지 확인합니다. 시퀀스 분석 소프트웨어를 사용하여 시퀀싱 결과를 분석하여 편집의 존재를 확인합니다.

Representative Results

rbm-3.2는 인간 분열 자극 인자 2 타우 변이체(WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)에 상동성을 가지는 PUTATIVE RNA 결합 단백질이다. RBM-3.2 단백질은 단백질 인산염 1(GSP-1)과 규제 억제제-2(I-2SZY-2)및 SDS-22의 결합 파트너로 확인되었으며, 이는 이러한 단백질을 C. elriole 중복(데이터 표시되지 않음)의 새로운 레귤레이터로 식별한 이전 연구에서확인되었다. 현재, C. elegans에서 rbm-3.2 유전자의 기능에 관하여 거의 알려지지 않습니다. 따라서, C. elegans rbm-3.2 유전자의 생물학적 역할을 추가로 조사하기 위해, rbm-3.2-null알렐레 rbm-3.2(ok688)는 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)로부터 수득되었다. 불행하게도, 전체 rbm-3.2 유전자의 삭제를 소유하는 것 외에도 rbm-3.2 (ok688) 유전자는 또한 겹치는 유전자, rbm-3.1의 부분 삭제를 초래하여 유전 분석을 복잡하게 만듭니다. 따라서 C. elegans에서 rbm-3.2 유전자의 역할을 정확하게 조사하기 위해 CRISPR/Cas9 편집을 사용하여 C. elegans rbm-3.2 코딩 영역의 시작에 매우 가까운 3개의 조기 정지 코돈을 도입하여 겹치는 rbm-3.1 유전자를 그대로 유지했습니다. 이러한 조기 정지 코돈을 C. elegans rbm-3.2 유전자에 도입하기 위해, 우리는 DNA (도 1A)의반대 가닥 (템플릿 가닥)에 위치한 PAM 모티브를 가진 crRNA를 설계했다. Cas9 컷 사이트는 rbm-3.2 스타트 코돈 ATG에서 떨어진 6 개의 기지에 위치했습니다. rbm-3.2 유전자에 조기 정지 코도를 소개하려면, 우리는 다음과 같은 다섯 가지 주요 특성을 가진 수리 템플릿을 설계: 1) 35 rbm-3.2 업스트림rbm-3.2 시작 코돈 (왼쪽 homology arm) 2) PAM 모티브를 포함하는 기지의 짧은 스트레칭이 삭제된 3) 에코리 제한 사이트는 스크리닝을위한 시작 코돈 직후 도입되었다 4) 두 번째 및 세 번째 codons의 3 개의 코돈 3스톱 코돈은 rbm-3.2 mRNA 5) 35기의 끊김 없는 상생학의 번역을 중단하기 위해 제5 RBM-3.2 코돈 후 도입되었다-3.2 rbm-3.2의 첫 번째 인트론에 중단되지 않는 호생학의 기재는 편집의 하류로 포함되었다(오른쪽 homology arm)(도 1B) 이 CRISPR 실험을 위한 사출 믹스는 표 I에표시된 대로 제조하였다. 주사 혼합물은 리보뉴클레오단백질 복합체를 조립하기 위해 15분 동안 37°C에서 배양되었다. 혼합물은 원심 분리되어 뽑아낸 미세 주입 바늘에 로드되었습니다. C. elegans gonad내미세주입은 Iyer 외. 201943에기술된 바와 같이 수행되었다. 그림 2는 이 프로토콜을 사용하여 편집된 C. elegans를 생성하기 위한 실험 타임라인을 묘사합니다. 우리는 일반적으로 각 CRISPR 실험에 대해 30 개의 웜을 주입하지만, 일부 실험실은 각 CRISPR 실험에 대해 더 적은 웜 (10에서 20 사이)를 주입합니다. 더 많은 벌레를 주입하면 양성 편집을 찾을 확률이 높아지므로 더 많은 수의 웜을 주입하는 것을 선호합니다. 많은 실험실은 선별을 위해 “잭팟”무리 (50 % 이상의 롤과 Dpy 자손접시)를 선택합니다. 몇 가지 CRISPR 실험을 수행 한 후 우리의 경험에서, 잭팟 무리가 때때로 발생하지만, 대부분의 시간, 스크리닝을 위해 선택되는 롤 웜은 종종 많은 다른 P0 플레이트에서 온, 각각 몇 롤 자손으로 구성. 이 실험에서는 잭팟 무리가 얻을 수 없습니다. 전체적으로, 우리는 편집의 존재를 위해 7 주입 P0 웜에서 얻은 73 F1 롤 웜의 게놈 DNA를 선별하였다. rbm-3.2 유전자의 시작 코돈과 관련하여 스크리닝 프라이머 및 이들의 위치의 서열은 도 3A에나타낸다. 분석을 통해 73개의F1 웜 중 7개가 편집에 긍정적인 것으로 나타났다(9.5%) (그림 3B). 편집되지 않은 벌레는 EcoRI 소화 시 445 bp의 단일 DNA 조각을 표시했습니다. 반면, rbm-3.2 유전자에서 조기 정지 코동을 운반하는 벌레는 EcoRI 소화시 각각 265bp 및 166 bp의 두 개의 단편을 나타냈다. 이테로지구스 편집된 벌레는 에코리 소화시 3개의 단편을 표시했습니다: 445 bp의 1개의 야생형 편집되지 않은 DNA 단편 및 rbm-3.2 유전자의 편집된 사본에서 각각 265bp 및 166 bp의 2개의 DNA 단편. 균질 편집을 운반하는 벌레를 식별하기 위해 확인된 양성 F1 이종고원에서 12 개의 F2 웜을 새로운 개별 플레이트로 옮기고 자손 (F3)을생성 할 수있었습니다. F2 웜은 앞서 설명한 바와 같이 동종질에 대해 선별되었다. 12명 중 6명(50%)이 가려진 벌레가 우리의 관심 있는 편집을 위해 동종구(그림 4A)로나타났다. 확인된 균질 응모의 유전체 DNA는 DNA 염기서열 분석 반응을 설정하기 위하여 이용되었습니다. DNA 염기서열 분석결과, 상동성상태에서 편집의 존재를 확인하였다(도4B). 일반적으로, 모든 동종구스-편집된 웜 라인이 동일한 표현형을 나타내는지 확인하기 위해 다중 동종벌레 웜 라인을 시퀀스하는 것이 유리하다(null-돌연변이가 특정 표현형을 생성하는 경우). 또한, 서부 블로팅 이나 RT-PCR 등 발현 기반 분석 또는 표현형 분석을 통해 유전자 녹아웃을 검증하는 것도 필요할 수 있다. 이는 유전자의 시작 부분에 조기 정지 코돈이 도입되긴 하지만, 대체 ATG가 조기 정지 코돈의 하류에 존재할 수 있기 때문이다. 이 ATG는 부분적으로 기능적인 잘린 단백질의 결과로 단백질 발현을 시작하는 데 사용될 수 있었습니다. 시약 농도 추가할 볼륨 20% 글리세롤을 곁들인 뉴클레아제 없는 물에 있는 Cas9 단백질 2 μg/μL 5 μL 5 mM 트리스-Cl pH 7.5의 tracrRNA 4 μg/μL 5 μL 5mMM 트라이-Cl pH 7.5에서 dpy -10 crRNA 8 μg/μL 0.4 μL rbm-3.2 crRNA 에서 5 mM 트리스 -Cl pH 7.5 8 μg/μL 1 μL 멸균뉴클레아제 없는 물에 dpy -10 수리 템플릿 500 ng/μL 0.55 μL 멸균뉴클레아제 없는 물에서 rbm -3.2 수리 템플릿 1 μg/μL 2.2 μL 멸균 핵증 없는 물에서 KCl 1 M 0.5 μL 멸균 뉴클레아제 없는 물 – 5.35 μL 표 1: 리보뉴클레오단백질 복합체및 dpy-10을 공동 CRISPR 마커로 사용하여 CRISPR/Cas9 편집을 위한 사출 믹스의 성분. 사출 믹스를 만드는 동안 멸균 기술과 RNase 프리 시약을 사용합니다. 멸균, 비 DEPC 처리 뉴클레아제 없는 물은 사출 혼합을 만들기 위하여 이용되었다는 것을 주의하십시오. 시약 농도 추가할 볼륨 KCl 1 M 5 mL 트리스-HCl pH 8.3 1 M 1 mL MgCl2 1 M 250 μL NP-40 (또는 IGEPAL CA-630) 100% 450 μL 트웬-20 100% 450 μL 젤라틴 2% 500 μL 물 – 92.35 mL 표 2: 웜 리시스 버퍼 레시피. 웜 용해 버퍼는 대량, 오토클레이브, 필터링 및 알리인용으로 장기 저장을 위해 만들 수 있습니다(참고: 용해 버퍼는 실온에서 1년 이상 보관할 수 있음). 1:100 희석 20 mg/mL 단백질Ae K를 각 사용 직전에 웜 리시스 버퍼에 넣습니다. 그림 1: rbm-3.2 조기 정지 CRISPR에 대한 crRNA 및 수리 템플릿 디자인을 보여주는 회로도. a.rRNA 서열 및 템플릿 가닥에 위치한 PAM 모티프 서열을 가진 rbm-3.2 유전자의 코딩 및 템플릿 가닥을 표시하는 회로도. B. 3.2 유전자에 3개의 조기 정지 코동을 도입하기 위해 합성된 수리 템플릿의 상이한 특성을 나타내는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: CRISPR/Cas9 편집에 의해 균질저 편집 C. 엘레간을 생성하기 위한 실험 타임라인및 dpy-10을 공동 CRISPR 마커로 사용한다. CRISPR/Cas9 편집 방법을 사용하여 동종구스 편집C. elegans를 생성하기 위해 수행해야 하는 단계의 일별 분석입니다. 간단히, 30개의 벌레는 마이크로 주입을 사용하여 CRISPR 편집 믹스를 주입하고 OP50 대장균으로시드된 개별 MYOB 플레이트에 분리되었다. 24 시간 후에 주입 된 P0 웜은 신선한 MYOB 플레이트로 옮겨져 계란을 계속 낳을 수있었습니다. 3일과 4일에 미세 주입 후, 플레이트는 Rol F1 웜의 존재를 검사했습니다. 최대 수의 롤과 Dpy F1 웜을 가진 플레이트가 선택되었고 73 F1 Rol 웜(CRISPR 실험당 50~100F1 Rol 웜)은 새로운 개별 MYOB 플레이트(플레이트당 1웜)에 단독으로 배치되어 약 2일 동안 알을 낳을 수 있었다. 미세먼지 주입 후 6일째에, 벌레 용액은 자손(F2)을 생산한F1 웜으로부터 제조되었고, 다음에 에코RI 및 아가로즈 겔 전기포와 함께 PCR에 의한 편집의 존재를 위해 선별하였다. 7일째, 12일 비롤, 비DpyF2 웜은 양성판에서 새로운 개별 플레이트로 이송되어 자손(F3)을생성할 수 있었다. 9일째,F2 웜은 이전에 설명한 바와 같이 편집의 동종성 검사를 받았다. 10일째에, 웜 리시스, PCR 및 PCR 정화는 동종제 F3 벌레를 위해 수행되었고 DNA 농도는 나노드롭 분광계를 사용하여 측정하였다. 11일째에, Sanger 시퀀싱 반응은 양성 견본을 위해 설치되고 DNA 순서를 위한 반응이 전송되었습니다. 12일째에 시퀀싱 결과를 분석하고 시퀀스 분석 소프트웨어(예: CLC 시퀀스 뷰어)를 사용하여 편집의 존재를 검증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: rbm-3.2 조기 정지 코돈에 대한 이종고우스 C. 엘레간에 대한검사. 에코리로 소화된 C. 게놈 PCR DNA의 아가로즈 젤 전기포고심 이미지. 73개의 개별 F1 웜은 유전자형으로 rbm-3.2 편집의 존재를 위해 스크리핑되었다. 적색 숫자와 별표는 긍정적으로 편집된 웜을 나타냅니다. 확인된 7개의 모든 7명의 고척은 EcoRI 소화시 rbm-3.2 유전자의 편집된 사본에서 각각 445bp및 166bp의 1개의 야생형 편집되지 않은 DNA 단편과 265bp 및 166bp의 2개의 DNA 단편을 전시했기 때문에 편집을 위해 이종수구우스였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: rbm-3.2 조기 정지 코돈을 운반하는 동종 구스 편집 C. 예르간을 식별하고 검증합니다. A. rbm-3.2 조기 정지 코돈에 대한 동형 질주 C. 엘레건의 검사. 에코리로 소화된 C. 엘레간게게놈 DNA의 아가로즈 젤 전기포고이 이미지. 양성 플레이트에서 12개의 개별 F2 웜은 유전자형으로 rbm-3.2 편집의 동질성을 위해 선별되었다. 빨간색: 동질이 편집된 웜. 12개의 선별된F2 웜 중 6개(50%)는 rbm-3.2 조기 정지 코돈에 대해 동종구였다. 웜 7에는 PCR 제품이 존재하지 않았습니다. B. DNA 염기서열에 의한 rbm-3.2에서 조기 정지 코돈의 삽입을 확인한다. 편집되지 않고 편집 된 동질화의 DNA 및 단백질 서열의 비교를 보여주는 회로도. 동종구균편집웜에서 게놈 DNA의 DNA 염기서열 분석 결과 CRISPR/Cas9 편집 시 rbm-3.2 유전자에 있는 3개의 조기 정지 코돈의 존재를 확인했습니다. CRISPR/Cas9 편집 후 모든 결과 아미노산 변경 빨간색 문자 또는 빨간색 별표로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

우리는 rbm-3.2 외에 몇몇 유전자를 편집하기 위하여 위의 프로토콜을 이용했습니다. 다른 loci, 가이드 RNA 및 수리 템플릿 (단일 좌초 및 이중 좌초)에 대한 편집 효율성은 2 %에서 58 %(표시되지 않은 데이터)에 대해 다양합니다. 관찰된 편집 효율성은 이^{프로토콜(27)에}대해 이전에 보고된 편집 효율이 2%에서 70%로 보고된 것과 비슷하다. 우리는 또한 유전자 삭제를 만들기에 있는 이 기술을 사용하여 성공했습니다. 2개의 crRNA를 사용하여 우리는 녹색 형광 단백질 (GFP)를 위한 코딩 서열로 길이 6 kb에 가까운 유전자를 대체했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 이 실험을 위해, 분석된 Rol F₁ 벌레의 약 14%는 유전자 삭제 및 GFP로 의교체에 대해 양성인 것으로 나타났다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, 추가 실험은 이 기술을 사용하여 수행할 수 있는 유전자 삭제 및 교체의 최대 길이를 결정하기 위하여 요구됩니다.

이 기술은 길이^19에서약 1.6 kb인 삽입을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 이 프로토콜을 사용하여 길이가 1.6kb 이상인 삽입을 만들고, 두 개의 이중 가닥 브레이크를 생성하고, 더 긴 상동성 팔을 가진 수리 템플릿을 사용하면 훨씬 더 큰 DNA 조각(~10Kb)을 삽입할 수 있는 것으로 나타났다(~10Kb)^28. 대안적으로, 이 프로토콜을 가진 유전자 편집의 다중 라운드는 더 큰 편집을 생성하기 위하여 수행될 수 있습니다. 다른 플라스미드계 C. elegans CRISPR/Cas9 유전자 편집 프로토콜은 또한 1.6 kb^{46,47,48보다}큰 DNA 단편의 삽입을 포함하는 CRISPR^실험에대해 채택될 수 있다.

유전자 편집을 위해 이 프로토콜을 사용하기 전에, 관심있는 유전자가 염색체 II에 dpy-10 궤적에 연결되지 않도록 할 필요가있다. dpy-10에연결되는 표적 유전자의 경우, dpy-10 돌연변이를 관심 있는 편집에서 멀리 분리하는 것이 문제가 될 수 있습니다. 따라서, 관심 유전자가 dpy-10 궤적, unc-58 (X 염색체)및 unc-22 또는 zen-4 (염색체IV) 및 벤-1 또는 파-1(염색체 III)과 같은 다른 공동 CRISPR 마커에 연결되는^{경우, 26, 25, 25, 26을다른}염색체에 위치하게 될 수^있다. 마이어 연구소의 데이터는 벤-1 및 zen-4 돌연변이가 이^{방법(28)으로}스크리닝을 위한 성공적인 공동 CRISPR 마커로 사용될 수 있음을 보여준다. 그러나, zen-4 및 pha-1을 공동 CRISPR 마커로 사용하면 비야생형 zen-4(cle10 ts) 또는 pha-1(e2123 ts) 배경에서 CRISPR 실험을 수행해야 하는 것이^{중요하다.} 또한, 벤-1과 같은 일부 공동 CRISPR 마커를 포함하는 CRISPR 실험은 특수 플레이트(예: 벤지미다졸을 함유한 플레이트)의 제조를 요구할 수 있다( 예를 들어 벤지미다졸을 함유한 플레이트)^(28). 우리는 성공적으로 이 방법을 사용하여 dpy-10에 연결되는 유전자에 대한 양성 편집을 위해 선별하기 위해 unc-58 공동 CRISPR 마커를 사용했습니다 (데이터는 도시되지 않음). unc-58(e665) 돌연변이는 양극으로 편집된^웜(24)을위해 효과적으로 검사하는 데 사용할 수 있는 눈에 보이는 표현형(마비)을 부여한다. 대안적으로, 형광 현미경에 접근할 수 있는 경우에, 형광 태그 gtbp-1 유전자는 또한 이 프로토콜에 대한 공동 CRISPR 마커로 사용될 수^있다(19).

이 게놈 편집 방법을 사용하는 동안 높은 편집 효율을 위해 편집 부위는 Cas9 절단 부위에서 10~30개의 베이스 이내여야 합니다. 편집 사이트가 Cas9 절단 현장에서 30개 이상의 기지인 경우 편집 효율이^{크게 19,35,37로}떨어집니다. 그러나, 마이어 실험실에서 최근 연구는 서로 거리에서 두 개의 이중 가닥 나누기를 만드는 것이이 프로토콜을 사용하여 Cas9 컷 사이트에서 멀리 편집의 삽입을 가능하게 할 수 있음을 보여 주었다^28.

현재 프로토콜에서 수리 템플릿은 삽입된 세 개의 정지 코돈이 모두 동일한 판독 프레임에 나타나도록 설계되었습니다. 그러나 null 돌연변이를 만드는 대체 전략은 이전에^설명된범용 43기지 긴 노크인 STOP-IN 카세트를 사용하는 것입니다. 중요한 것은, 이 카세트는 가능한 모든 3개의 독서 프레임에 있는 codons를 중단하고 프레임 교대 돌연변이를 일으키는 원인이 됩니다. 편집 사이트에서 부적절하거나 불완전한 복구가 발생할 때 null 돌연변이를 생성하는 데 특히 유용한 전략입니다.

결론적으로, 이 방법의 짧은 기간 및 최근 발전으로 인해, 이것은 짧은 면역 원성 에피토프 태그, 형광 태그, 유전자 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체의 추가를 포함하는 일상적인 실험실 실험을위한 훌륭한 방법입니다.

Materials

Barcoded DNA sequencing tubes	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Premixed	N/A
Cas9 protein	PNA Bio	CP01	Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	N/A	Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
ECoRI	New England Biolabs	R3101S	Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit	Qiagen	28004	Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix	Meridian Bioscience	BIO-25043	Stored at -30 °C
Primers	IDT	N/A	Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K	Gold Bio	P-480-SL4	Stored at -30 °C
Repair template oligos	IDT	N/A	4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA	Horizon Discovery/ GE Dharmacon	U-002005-50	Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C